Leticia Rayas González

1. La replicación del DNA requiere a la proteína Plx1 bajo condiciones de estrés. Kristina Trenz, Alessia Errico y Vincenzo Costanzo Leticia Rayas González

2. Plx1 y condiciones de estrés Plx1 es una cinasa apagada es el ortólogo de plk1 Inducción de Afidicolina (APH) de la horquillas de(inhibe la replicación DNA replicación polimerasa II ) estancadas Etoposido (se une a la enzima topoisomerasa II. Esto lleva a la interrupción de la replicación y la transcripción del ADN. Reducción de complejos Mcm de unión a ADN. www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/picrender.fcgi...

3. Plk1 • Se expresa a través del ciclo celular pero su función durante la fase S es desconocida. • Se une a la cromatina y suprime el puesto de control dependiente de ATM / ATR de la interfase S que inhibe la activación del origen. Esto permite que Cdc45 desreprima el inicio de la replicación del ADN. • La activación del punto de control aumenta la unión de Plx1 al complejo Mcm a través de su dominio caja Polo. El reclutamiento de Plx1 a cromatina es independiente de los mediadores del puesto de control Tipin y Claspina. • El reclutamiento de Plx1 a cromatina y la recuperación de la replicación del ADN bajo estrés requieren la fosforilación de la serina 92 de la proteína Mcm2 dependiente de ATR. • La depleción de Plx1 conduce a la acumulación de roturas cromosómicas que se previenen mediante la adición de Plx1 recombinante. • Estos datos sugieren que Plx1 promueve la estabilidad del genoma mediante el control de la replicación del ADN en condiciones de estrés.

4. Complejo Mcm Complejo Mcm El complejo Mcm actúa como helicasa promoviendo la replicación.  En la fase G1, la Cdk (ciclina) promueve la adición de Cdc6 para reclutar a Mcm, formando un complejo prerreplicativo. Al inicio de la fase S, la Cdk-S produce la disociación de Cdc6 y su proteólisis, exportando a Mcm al citosol. (Nougarede et al. 2000, Coleman et al. 1996, Takisawa et al. 2000 and references therein.)

5. Punto de control del ciclo celular en respuesta al daño ATM y ATR fosforilan componentes de la red, directamente (rojo 'P') o a través de cinasas CHK2 y CHK1 (negro 'P'). ATM / ATR y CHK2/CHK1 también afectan la reparación del ADN, la transcripción, el ensamblaje de la cromatina y la muerte celular. www.nature.com/.../fig_tab/nature03097_F3.htm

6. Proteína Plx1 y la replicación del ADN Western blot ¿Se requiere Plx1 para la replicación del ADN ? B: Replicación (120 Min.) La depleción de Plx1 en interfase no afecta la replicación del ADN. ¿Se requiere Plx1 en condiciones de estrés? F: Plx1 activa no inhibe la replicación del ADN , en cambio la depleción de Plx1 sí

7. Controles A: Depletando Plx1 con anticuerpos. Suplementando con Plx1 recombinante. (2000 núcleos/µl) C: Limitando el número de orígenes de replicación D: Extractos suplementados con alto # de núcleos y dosis altas de geminina (GEM):No afectan la replicación. E: En la replicación con estrés inducido se fosforila Chk1, activando el punto de control dependiente de ATM/ATR

8. ¿La unión de Plx1 a cromatina mejora en presencia de horquillas de replicación estancadas? La unión Plx1/ Mcm7 cargado sobre cromatina se incrementó arriba de 4 veces en presencia de APH en comparación con el control.  ¿Cómo lo determinaron? Comparando la unión de Plx1 y de Mcm7 a cromatina en presencia de APH y GEM: (A) En presencia de bajos niveles de DNA unido a complejos Mcm. Con bajas cantidades de APH se observó un efecto similar al control (B) Cuantificaron la unión de Plx1 a cromatina y a Mcm7  en presencia de APH (etapas tempranas de la replicación)

9. Puntos de control sensibles a cafeína Western blot A) Probar si los efectos de Plx1 sobre el DNA eran mediados por puntos de control sensibles a cafeína* durante la interfase S La cafeína podría restaurar la capacidad de la replicación del DNA en ausencia de Plx1 y en presencia de APH o GEM Lo que sugiere que Plx1 suprime el punto de control de la interfase S.

10. Regulación del disparo de origen D) Se sugiere que Plx1 regula el disparo de origen al disminuir los niveles de fosforilación de Plx1.

11. Controles B) Midieron los efectos de Plx1 sobre la señalización de Chk1, blanco del punto de control de S sensible a cafeína C) Midieron el estado de activación de Chk1en condiciones de estrés.

12. Arresto de la replicación, monitoreo de la unión de Mcm y Cdc45 a cromatina A) Para entender el mecanismo molecular del arresto de la replicación se monitoreó la unión a cromatina de los complejos Mcm y Cdc45 Para verificar si el daño a Cdc45 reprime la actividad Cdk2 B) Medición de la actividad nuclear por monitoreo de la incorporación de 32P en la histona H1 después de inmunoprecipitación nuclear de Cdk2 con anticuerpos

13. Reclutamiento de Plx1 a la cromatina por Claspina al inicio de la replicación (estrés). Plx1 fosforila a Claspina, un mediador de la activación de Chk1 induciendo su liberación de la cromatina y promoviendo la adaptación al punto de control que retrasa el comienzo de la mitosis. Probar si la Claspina interviene en el reclutamiento de Plx1 a cromatina. (B) La acumulación de Plx1 en la cromatinainducida por horquillas de replicación estancadas no se afecta por la ausencia de Claspina  Controles: (A) Depleción de Tipin

14. Interacción de Plx1 con Mcm durante la fase S (C) Interacción de Plx1 con Mcm para identificar el mecanismo de reclutamiento de Plx1 a cromatina F) Plx1 es incapaz de unirse a cromatina en extractos depletados del complejo Mcm lo que sugiere que Mcm es el mayor sitio de unión de Plx1 a cromatina durante la fase S.

15. Importancia de Mcm para la función de Plx1 D) Identificación de la región de Plx1 que se une a Mcm E)¿La unión de la caja Polo a proteínas Mcm se incrementa con la activación del punto de control? Sí y se inhibe con cafeína. Mcm2, Mcm4, Mcm6 y Mcm7

16. Requerimiento de fosforilación serina 92 de Mcm2 para la función de Plx1 • Mcm2 es fosforilada sobre la serina 92 por ATM/ATR y su fosforilación puede estar inducida por APH o etoposido • Para Probar si la fosforilación de esta serina tiene que ver en el papel del reclutamiento de Plx1 a Cromatina y en la supresión del punto de control mediado por Plx1, se produjo un Mcm2 recombinante • B) ¿Plx1 recombinante restaura la replicación de DNA bajo condiciones de estrés con Mcm2-WT o con Mcm2 recombinante? Sustitución de serina por alanina

17. Plx1 previene el rompimiento cromosomal durante la replicación del DNA ¿La ausencia de Plx1 conduce a la pérdida de la integridad del genoma? Se midió el incremento de rompimientos cromosomales en ausencia de Plx1 reduciendo los niveles de unión de Mcm a DNA

18. Activación del origen de replicación durante la fase S

19. Gracias