Клональное размножение растений in vitro

1. Клональное размножение растений in vitro

2. Вегетативное размножение Сельскохозяйственные или декоративные растения размножают вегетативным способом в том случае, если они имеют специальные органы для такого типа размножения (клубни, луковицы, клубнелуковицы, столоны) или у них растянутый ювенильный период, что удлиняет сроки получения урожая, затрудняет селекционную оценку отдельных генотипов (древесные и кустарниковые культуры). Сорта, породы вегетативно размножаемых растений – это, как правило, сложные гетерозиготы, нередко полиплоиды. Воспроизвести их генотип путем семенного размножения практически невозможно.

3. Вегетативное размножение Недостатки: Коэффициент размножения при естественном вегетативном размножении, как правило, не такой высокий, как при семенном размножении. Семенные клубни, луковицы намного крупнее обычных семян. Для их хранения нужны большие хранилища, в которых должна поддерживаться определенная температура, влажность, что нередко связано со значительными затратами энергии. Сорта вегетативно размножаемых культур в ходе вегетации накапливают разнообразные инфекции, которые передаются последующим поколениям. Поддержание генетических коллекций вегетативно размножаемых культур связано со значительными затратами.

4. Преимущества клонального размножения растений in vitro Высокий коэффициент размножения Возможность эффективно размножать те растения, которые с трудом размножаются традиционными методами Возможность круглогодичных работ, для их проведения не требуются большие площади При размножении растений в пробирках не возникает угрозы их повторного заражения вирусными и другими болезнями (при условии, что исходное маточное растение является здоровым)

5. Использование культуры апикальных меристем для получения свободного от патогенов посадочного материала Инициальные клетки апикальных меристем характеризуются высокой цитогенетической стабильностью: на протяжении всей жизни растения они, как правило, сохраняют генотип зиготы Важное свойство меристемных тканей – отсутствие в них или крайне низкие концентрации вирусных частиц даже у пораженных вирусами растений В 1952 г. Морель и Мартэн (Morel, Martin, 1952) разработали методику оздоровления растений георгинов с помощью культуры in vitro апикальных меристем размером около 100 μм. С тех пор этот метод с разной степенью эффективности нашел применение для широкого круга вегетативно размножаемых растений.

6. Использование культуры апикальных меристем для получения свободного от патогенов посадочного материала Первым этапом промышленного размножения является отбор наиболее продуктивных клонов маточных растений, в наибольшей степени соответствующих описанию сорта, древесно-кустарниковой породы, или выделяющихся по комплексу положительных характеристик. Отобранные визуально здоровые маточные растения до введения в культуру дополнительно проверяют на наличие основных вирусов с использованием различных методов: биотестов (заражения растений-индикаторов, то есть особо чувствительных к патогену), электронной микроскопии, иммуноферментного анализа (ИФА) – ELISA (от англ: enzymelinkedimmunosorbentassay). В последнее время находят применение методы, основанные на анализе нуклеиновых кислот патогенов: электрофорез, in situ гибридизация в сочетании с применением различных меток (например, NASH – nucleic acid spot hybridization), варианты ПЦР-анализа (например, RT-PCR – reverse transcription polymerase chain reaction).

7. Иммуноферментный анализ

8. Спектрофотометр для оценки результатов ИФА

9. Использование культуры апикальных меристем для получения свободного от патогенов посадочного материала Культуру in vitro апикальных меристем получают, вычленяя в условиях асептики под бинокулярным микроскопом верхнюю часть конуса нарастания стебля размером около 200 μм и помещая его на агаризованную питательную среду. В питательную среду, помимо цитокининов и ауксинов, добавляют небольшое количество гиббереллина. Культивирование проводят на свету. Эффективность оздоровления зависит от размера эксплантата и вида вируса. Так, путем культивирования апикальной меристемы картофеля удалось получить 70% растений-регенерантов, свободных от Y-вируса картофеля (PVY), и только 10% растений без Х-вируса (PVX).

10. Светоустановка для микроклонального размножения растений

11. Использование культуры апикальных меристем для получения свободного от патогенов посадочного материала Для повышения эффективности оздоровления от вирусной инфекции с помощью культуры меристем маточные растения перед вычленением эксплантатов подвергают термотерапии - продолжительному воздействию повышенных температур. Термотерапию проводят в климатических камерах при 37 °С и относительной влажности 90 %; освещенность растений около 5 тыс. люкс, фотопериод 16 час. В течение первой недели растения постепенно адаптируют к повышенным температурам, ежедневно повышая ее на два градуса с 25 до 37 °С. Продолжительность термотерапии разная в зависимости от вида растений и вирусов. Например, для оздоровления гвоздики достаточно 10–12-недельного воздействия теплом. Применение термотерапии в сочетании с культурой меристем дало возможность получить более 70 % свободных от вирусов растений-регенерантов хмеля, 90 % растений земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины, более 80 % растений картофеля. Показана эффективность термотерапии для лечения болезней, вызванных микоплазмами.

12. Использование культуры апикальных меристем для получения свободного от патогенов посадочного материала Хемотерапия(химиотерапия) заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, различных веществ, обладающих противовирусной активностью. Чаще всего для этих целей используют синтетические аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований: цианогуанозин, 2-тиоурацил, Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название – вирозол), а также интерферон, ридостин (рибонуклеат натрия), биназу (микробную рибонуклеазу), фенолкарбоновые кислоты: салициловую, галловую, сиреневую, кофейную, феруловую, кумаровую. Положительные эффекты хемотерапии отмечены для ряда древесных и кустарниковых культур (черешни, сливы, малины, смородины), некоторых цветочных культур. Применение хемотерапии дает возможность повысить эффективность оздоровления растений от вирусов с помощью культуры меристем с 40% до 80-100%.

13. Клональное размножение растений in vitro Методы микроразмножения: активация развития уже существующих меристем (апекса стебля, пазушных и спящих почек стебля); индукция адвентивных почек у эксплантата или в каллюсной культуре; соматический эмбриогенез.

14. Клональное размножение растений in vitro Активация развития уже существующих в растении меристем основана на снятии апикального доминирования. Апикальное доминирование– подавление роста боковых почек растительного побега при наличии верхушечной почки. Снять его у пробирочных растений можно двумя путями: удалением верхушечной почки или добавлением в питательную среду цитокининов. В случае использования цитокининов для снятия апикального доминирования развитие пазушных почек возможно без удаления верхушечной почки. При этом из почек эксплантата и побегов, тронувшихся в рост из верхушечной и пазушных почек эксплантата, формируется конгломерат побегов (аксиллярное ветвление)

15. Микроклональное размножение картофеля (активация существующих меристем)

16. Клональное размножение растений in vitro

17. Клональное размножение растений in vitro Метод клонального размножения растений in vitro путем индукции адвентивных почек основан на свойстве тотипотентности растительной клетки. Суть его заключается в том, что эксплантаты разных частей и органов растений, не содержащие стеблевых почек, способны их образовывать in vitro при наличии факторов, индуцирующих стеблевой органогенез. В качестве эксплантатов могут быть сегменты листовых пластинок и черешков, молодых соцветий, чешуй и донца луковиц, клубнелуковиц, корневые черенки, боковые и интеркалярные меристемы и другие органы и ткани. Стеблевые почки возникают de novo как в эпидермальных, так и супэпидермальных слоях эксплантата. Поскольку они появляются в «необычном» для растения месте, их называют адвентивными (добавочными).

18. Образование адвентивных почек на листовых эксплантатах льна

19. Клональное размножение растений in vitro Индукция адвентивных почек из тканей эксплантата - наиболее распространенный метод микроразмножения луковичных цветочных растений (лилий, нарциссов, гиацинтов, тюльпанов) – из луковичных чешуй, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантатов листьев; земляники садовой – из основания побегов, регенерированных в культуре меристем; представителей рода Brassica(капусты цветной, кочанной, брюссельской, брокколи) – из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; салата цикорного – из сегментов листовых пластинок; петуний – из сегментов корней; глоксиний, сенполий, стрептокарпуса, эхинапсуса – из сегментов листовых пластинок.

20. Соматический эмбриогенез в клеточной суспензии in vitro арахиса

21. Инкапсуляция соматических эмбриоидов В 1970-е годы Т. Мурасиге высказал идею инкапсуляции соматических эмбриоидов с целью получения искусственных семян. Она была реализована на практике в начале 1980-х: применительно к высушенным соматическим эмбриоидам моркови (Kitto, Janik, 1982) и влажным (не подвергавшимся подсушиванию) эмбриоидам люцерны (Redenbaugh et al., 1984). Наибольшее распространение получила вторая из названных технологий, которая заключается в инкапсуляции соматических эмбриоидов в различные гелеобразные субстратанции на основе агара, альгината, карбоксиметилцеллюлозы, каррагинана, гельрита, пектата натрия и других. Лучшие результаты были достигнуты при использовании альгината.

22. Искусственные семена орхидей (соматические эмбриоиды, инкапсулированные в альгинатный гель) (А) и полученные из них проростки (Б)

23. Проблемы перевода растений-регенерантов из условий in vitro в условия ex vitro Особенности пробирочных растений: Сформированные при повышенной влажности и гетеротрофном питании листья имеют слабую анатомическую дифференциацию: палисадная ткань отсутствует или слабо развита, мезофилл в основном представлен клетками губчатой паренхимы с большим межклеточным пространством, хлоропласты имеют неорганизованные граны, низкое содержание хлорофилла и протеинов. Ферменты, ответственные за фотосинтез, обладают пониженной активностью. Сосудистая система листьев недоразвита. Многочисленные устьица остаются полностью раскрытыми и не реагируют на стимулы (темнота, CО2 , абсцизовая кислота и другие), которые в норме вызывают их закрытие. Защитное восковое покрытие практически отсутствует, а тот воск, который образуется, существенно отличается по химическому составу от воска на листьях растений, выращиваемых в окружающей среде (обладает пониженными гидрофобными свойствами). Стебли пробирочных растений недостаточно лигнифицированы, в них значительно меньше колленхимы и склеренхимы по сравнению с нормальными растениями. Клетки имеют тонкие оболочки, а межклеточное пространство увеличено, сосудистая система недоразвита. У многих растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков.

24. Приемы, позволяющие улучшить приживаемость растений Последний, перед высадкой растений, пассаж рекомендуют производить на более бедную по составу минеральных солей питательную среду, например, среду Уайта, концентрацию сахарозы уменьшают до 1%. Из среды полностью исключают цитокинины, оставляя только ауксины, стимулирующие корнеобразование (например, ИМК). Повышают интенсивность освещения (до 8-10 тыс. люкс), немного понижают температуру, при которой производят культивирование Добавка в питательную среду ретардантов роста, а также адаптогенов: янтарной кислоты, крезацина, Мивала-Агро, которые ингибируют рост стеблей в длину, вызывают утолщение корней, уменьшают листовую поверхность, увеличивают содержание хлорофилла и стимулируют образование воска на листьях. Снижение влажности воздуха в культуральных сосудах путем использования десикантов, охлаждения нижней части сосудов, а также простым удалением пробок из пробирок за 7-10 дней до высадки растений в грунт. Для ряда древесных культур благоприятный эффект дает микоризация пробирочных растений.

25. Пробирочные растения картофеля с микроклубнями

26. Регенерация растений картофеля из микроклубней

27. Направления практического использования клонального размножения растений in vitro Разработаны и широко используются промышленные технологии микроклонального размножения большого числа вида орхидей, а также других ценных цветочных и декоративных культур. Производство высококачественных семян картофеля Широкое применение нашли технологии микроклонального размножения древесных и кустарниковых культур, причем, не только различных плодовых и декоративных, но и культур, применяемых в городском озеленении, лесовосстановлении.

28. Сохранение ценного генофонда в условиях in vitro В условиях in vitro хранят генетические коллекции: сортов и пород вегетативно размножаемых культур, стерильных форм, растений, образующих семена, которые быстро теряют всхожесть или не выдерживают высушива- ние и пониженные температуры Применяют два основных подхода: - сохранение коллекций в виде медленно растущих культур пробирочных растений; - криоконсервация тканей или клеточных культур отдельных генотипов.

29. Сохранение генетических коллекций в виде медленно растущих культур пробирочных растений Методы замедления роста культур: пониженная температура культивирования (1-4оС для холодостойких и 8-16оС для теплолюбивых культур) пониженное атмосферное давление (0,5 мм рт. ст.) или снижение концентрации кислорода в воздушной среде (смесь инертного газа (азота) и кислорода в концентрации 1-10%), при которой производят культивирование; добавление в питательную среду осмотиков (6-10% сахарозы, 3-6% маннита или сорбита) или регуляторов роста, замедляющих рост растений (хлорхолинхлорид, гидразид малеиновой кислоты, 2,2-диметил гидразид янтарной кислоты (В-995), Фосфон Д); получение и хранение при пониженных температурах запасающих органов растений (микроклубней, микролуковиц, микроклубнелуковиц) или инкапсулированных соматических эмбриоидов.

30. Криоконсервация тканей или клеточных культур растений Методические подходы для сохранения жизнеспособности клеток при замораживании: выбор биологического объекта для криоконсервации использование криопротекторов (Проникающие в клетки протекторы: глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид (ДМСО), аминокислоты: пролин, аспарагин и другие) препятствуют формированию кристаллов льда путем образования водородных связей с молекулами воды. Непроникающие криопротекторы: сахароза, трегалоза, фиколл, альбумин, поливинилпирролидон защищают клетки от осмотических перепадов, связанных с замораживанием, снижают скорость роста кристаллов льда) прекультивирование подлежащих замораживанию объектов в специфических условиях, позволяющих уменьшить содержание воды в клетках (на питательных средах с 2-6% маннита или сорбита, ДМСО (2,5-10%), при пониженных температурах (4-6оС) высушивание в ламинарном потоке воздуха, с использованием силикагеля. Эффективно в сочетании с альгинатной инкапсуляцией

31. Криоконсервация тканей или клеточных культур растений Процесс криоконсервации клеток и тканей растений включает следующие этапы: замораживание (температуру понижают медленно, 0,5-1оС в минуту, до -35оС, выдерживают при этой температуре 15-30 мин и только после этого погружают материал в жидкий азот) хранение размораживание (помещая извлеченные из жидкого азота пробирки на водяную баню, нагретую до +37-40оС) рекультивирование