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TERAPIA GÊNICA

TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS. TERAPIA GÊNICA. Genética Humana Prof a . Dr a . Ana Elizabete Silva. TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS. Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo: -aliviar a dor -melhorar a qualidade de vida .

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TERAPIA GÊNICA

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Presentation Transcript

  1. TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS TERAPIA GÊNICA Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

  2. TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo: -aliviar a dor -melhorar a qualidade de vida amenizando os sintomas ao invés de agir na causa primária: o gene

  3. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO DOENÇAS MONOGÊNICAS -Tratamento se baseia na reposição da proteína deficiente → melhora do funcionamento ou minimizando as consequências de sua deficiência -efetivo em 12% dos distúrbios DOENÇAS COMPLEXAS – MULTIFATORIAIS -se o fator ambiental é conhecido: oportunidade efetiva de intervenção → modificação ou não exposição ao fator ambiental -tratamento cirúrgico ou médico Quanto mais precoce o diagnóstico e instituído um tratamento → mais favorável será a evolução dos pacientes.

  4. Transplante de órgão Ativação de um gene dormente Fornecimento da proteína Evitar o agente danoso Remoção do produto tóxico acumulado Dieta especial ADA e Talassemia: Medula óssea Talassemia Beta: Gene da cadeia  da hemoglobina Hemofilia A/B: fator VIII/IX de coagulação. Diabetes: insulina Xeroderma pigmentosum: luz solar D. Wilson: acúmulo de cobre  penicilamina e trientina Fenilcetonúria: dieta baixa de fenilalanina TRATAMENTO AO NÍVEL DO FENÓTIPO AFETADO

  5. DOENÇAS MONOGÊNICAS COM TERAPIA EFETIVA • Hiperplasia adrenal congênita: reposição hormonal • Fenilcetonúria: restrição dietética de fenilalanina • Hemofilia: reposição do fator • Imunodeficiência combinada grave: transplante de medula • Cistinúria: ingestão de líquidos: D-penicilina • Agamaglobulinemia: reposição de imunoglobulinas • Acidúria metilmalônica: vitamina B12 • Doença policística adulta: transplante renal

  6. DOENÇAS MULTIFATORIAIS COM TERAPIAS EFETIVAS • Fenda labial e palatina: cirurgia • Estenose pilórica: cirurgia • Cardiopatia congênita: cirurgia e medicação • Hidrocefalia: cirurgia e medicação • Hipertensão: medicação • Úlcera péptica: medicação e cirurgia • Epilepsia: medicação

  7. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS • Necessidade de uma avaliação a longo prazo: o tratamento aparentemente bem sucedido pode demonstrar-se imperfeito • Após longa observação apresenta inadequações: Ex. PKU Manifestam distúrbios de aprendizagem e comportamento → prejuízo no desempenho acadêmico Crianças bem-tratadas→ escapam de RM → QI normal

  8. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS Tratamento bem-sucedido de mudanças patológicas em um órgão → podem surgir problemas inesperados em tecidos, antes não observados (pacientes não sobreviviam tempo suficiente). Ex.: Galactosemia galactose-1-fosfato UDPG GALT Quadro clínico: Problemas gastrintestinais Cirrose hepática Catarata RM grave Criança tratada: Problemas de aprendizagem Mulheres desenvolvem insuficiência ovariana → toxidez continuada de galactose

  9. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS Outros exemplos: • Cistinose: acúmulo de cistina nos lisossomos → insuficiência renal → pacientes com transplante renal após envelhecimento → desenvolvem hipotireoidismo, diabetes e anomalias neurológicas • Retinoblastoma: tumor de retina → pacientes correm o risco de desenvolver outras malignidades independentes após a primeira década: osteossarcoma

  10. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS Efeitos colaterais a longo prazo: Exemplos: • Hemofilia: infusão do fator de coagulação → formação de anticorpos contra a proteína • Talassemia: transfusão de sangue → sobrecarga de ferro

  11. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO

  12. TRATAMENTO DAS DOENÇAS METABÓLICAS

  13. Desvio Metabólico: Distúrbios do ciclo da uréia -conversão da amônia em uréia -defeito enzimático → hiperamonemia -benzoato de sódio → ligação da amônia com glicina → hipurato Inibição: Hipercolesterolemia Familiar Lovastatina: redução 40 a 60% nos níveis de LDL-colesterol do plasma nos heterozigotos

  14. TRATAMENTO NO NÍVEL DA PROTEÍNA

  15. TRATAMENTO POR MODIFICAÇÃO DO GENOMA OU SUA EXPRESSÃO

  16. Terapia Gênica Envolve diversas tecnologias que têm em comum, um novo conceito terapêutico a introdução de material genético para atuar na causa fundamental da doença :o gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos • Descreve qualquer processo destinado a tratar ou aliviar doenças pela modificação genética das células do paciente.

  17. 1º Passo: Gene de interesse Organismo-alvo

  18. Gene + Redulagores 2º Passo: 3º Passo: Tecnologia DNA Recombinante - Virais - Não- virais Gene Vetor Organismo- alvo In vivo Transferência dos vetores Ex vivo

  19. TERAPIA GÊNICA EX VIVO x IN VIVO http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/genetica/contenido14.htm

  20. PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA Doença apropriada Estratégia de transferência: ex vivo ou in vivo Células alvo Vetor

  21. CÉLULAS ALVO Características: acessíveis, tempo de vida longo no corpo, alta taxa de proliferação Tipos de células alvo: • Células tronco (medula óssea- cordão umbilical) • linfócitos • fibroblastos de pele • células musculares (mioblastos) • células vasculares endoteliais • hepatócitos

  22. Vetor Ideal • Capacidade de acomodação de um transgene ilimitado; • Baixa imuno e citotoxicidade; • Expressão estável do transgene; • Direcionamento específico para células e tecidos; • Baixo custo; • Fácil produção e manipulação; • Regulação do gene exógeno no tempo e/ou quantidade

  23. 1. Inserção de um gene em um vetor 2. Contato Vetor / Célula 3. Entrada e transporte do gene até o núcleo da célula 4. Transcrição do RNAm a partir do gene 5. Tradução do RNAm em proteína 6. Secreção, fixação na membrana ou expressão citoplasmática da proteína

  24. http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/genetica/contenido14.htmhttp://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/genetica/contenido14.htm

  25. Escolha do Protocolo de Terapia Gênica • Patologia célula/tecido-alvo tamanho e tipo de transgene expresso tempo e quantidade de expressão desejada. • Exemplos: Fibrose Cística Parkinson Retinite Pigmentosa Tratar diretamente Órgão específico Tratar Sistemicamente Fígado e Músculo Hemofilia Doenças Metabólicas

  26. Escolha do Protocolo de Terapia Gênica Doenças monogênicas recessivas Expressão do gene funcional Silenciamento do gene anormal DNA Antisense Doenças Monogênicas Dominantes Doenças Adquiridas: HIV, Câncer, Cardiovasculares Mas também podem ser tratadas:

  27. CASO CLÍNICO Parte I: Criança com 8 meses é levado a emergência devido batida na cabeça. O levantamento da história médica mostrou que teve vários episódios de sangramentos nasais. O médico suspeitou de um distúrbio de coagulação e solicitou exame de triagem. Parte II: Os resultados da triagem de coagulação mostraram a análise de tempo de protrombina e funcionamento das plaquetas normais. Porém mostraram um tempo prolongado de protromboplastina parcial ativada, suspeitando de alteração de fator de coagulação. Os resultados mostraram que Ethan tem menos de 1% de atividade do fator IX de coagulação, consistente com diagnóstico de hemofilia B.

  28. CASO CLÍNICO Parte III: Os pais foram encaminhados a um hematologista e uma equipe de genética para explicar as características da doença (recessiva ligada ao X) e opções de tratamento. • Mutação no gene do fator VIII (Hemofilia A) ou IX (Hemofilia B) de coagulação • afeta 1:5000 homens • Sintomas: sangramento espontâneo nas juntas, nos tecidos moles e órgãos vitais • Tratamento: injeções regulares de fator VIII ou IX

  29. CASO CLÍNICO Parte IV: O hematologista explica sobre o tratamento usando uma infusão intravenosa de fator IX recombinante ou derivado de plasma. Devido a herança ligada ao X também solicita o teste genético na criança e na mãe. Geralmente uma mutação sem sentido que leva ao término de leitura prematuro da tradução da proteína. Mais de 2100 mutações diferentes http://maxianarellidebemcomavida.blogspot.com/2009_03_01_archive.html

  30. CASO CLÍNICO Parte V: Após 18 anos, Ethan foi internado várias vezes. Os pais ficaram sabendo sobre a terapia gênica e procuraram o hematologista para ser incluído no ensaio clínico. Neste ensaio a terapia é injetada diretamente no músculo 6 pacientes submetidos à terapia gênica • Procedimento: • extração de células da pele (fibroblastos) • inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição pelo organismo)  inseridos nos fibroblastos por choque elétrico  clonagem dos fibroblastos • pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem, após pequenas incisões • aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes) • benefícios foram temporários: apenas 10 meses

  31. CASO CLÍNICO Parte VI: Ethan participou de um ensaio de terapia gênica usando AAV recombinante direcionado ao fígado pela veia porta. Houve um pequeno aumento nos níveis de fator IX, mas ainda não o suficiente.

  32. Sucessos e Insucessos da Terapia Gênica - Imunodeficiência (ADA) Lewis, R., 2004.

  33. Sucessos e Insucessos da Terapia Gênica - Imunodificiência (ADA) • Deficiência da Adenosina Desaminase (1990) – Primeira Terapia Gênica • Duas meninas uma 4 e outra de 8 anos com SCID receberam seus próprios leucócitos intravenoso após tratamento com TG introduzido o gene normal para ADA; • Nos anos seguintes elas permaneceram relativamente saudáveis, mas com tratamento sendo repetido; • Uma precisou de PEG-ADA (enzima sintética) e a outra apresentou 25% de suas células T normais. • Desde 1991: > 90 pacientes foram tratados usando células fronco do cordão umbilical ou medula óssea • Os pacientes têm sobrevivido, a maioria sem terapia complementar

  34. Sucessos e Insucessos da Terapia Gênica Imunodeficiência Combinada Severa Ligada Ao X – XSCID • Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia  do receptor IL-2 • Pacientes faltam células T e células B prejudicadas • Paris: 10 crianças selecionadas para terapia gênica: células da medula óssea  retrovírus • 9/10 crianças apresentaram células T com o gene transduzidos • Duas crianças desenvolveram leucêmia de células T (~ 3 anos após a terapia)  inserção do retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2 • Londres: 17/20 pacientes apresentaram benefícios da terapia gênica (seguimento por 10 anos) após: 1 paciente desenvolveu leucêmia • Desses casos 1 paciente morreu devido leucêmia

  35. VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA • Universidade de Pensilvania: rapaz de18 anos faleceu durante triagem de TERAPIA GÊNICA  faleceu 4 dias após a terapia  falência múltipla de órgãos • Doença: deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC): doença ligada ao X  distúrbio do ciclo da uréia (fígado)  causa níveis impróprios de amônia no sangue Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhões de adenovírus)  injeção no fígado  altos níveis de IL-6  consequências sistêmicas  síndrome de resposta inflamatória sistêmica letal

  36. VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA • Julho/2007: mulher de 36 anos com artrite reumatóidefaleceu 22 dias após receber a segunda dose de um gene terapêutico para artrite. Após investigação pela FDA não foi possível atribuir a morte da paciente a terapia

  37. TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER • Cerca de 650 protocolos: triagem clínica • 2/3 dos protocolos de terapia gênica em estudo envolvem cânceres não herdados • introdução de genes supressores de tumor para restaurar a função perdida. • Ex.: inserção do gene TP53 normal em tumores de pulmão  bloquear a progressão tumoral e apoptose

  38. TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER • Imunoterapia: introdução de lipossomos com DNA para HLA-B27 em melanoma: • expressão de HLA-B27 na superfície das células e destruição pelas células T citotóxicas  regressão do melanoma em alguns casos

  39. Terapia Gênica no Brasil - Em 2004 foi criada a Rede de Terapia Gênica • 14 grupos de pesquisa dos estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, financiados pelo Institutos do Milênio do CNPq/MCT. • Pesquisas: introdução de genes com efeito terapêutico Qual o alvo do Brasil? - terapia gênica em câncer - doenças graves do metabolismo - doenças degenerativas e cardiovasculares - vacinas de DNA profiláticas para doenças infecciosas e vacinas de DNA terapêuticas para HPV

  40. Terapia Gênica no Brasil • Rede é composta por: • Rio de Janeiro: o Instituto de Biofísica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Câncer (InCa); • São Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butantã; • Rio Grande do Sul: os Departamentos de Genética e de Biofísica e o Hospital de Clínicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

  41. ESTRATÉGIAS PARA TERAPIA MOLECULAR

  42. TERAPIA MOLECULAR • Gleevec (Imatinib):bloqueia proteína quimérica abl-bcr na LMC • Herceptin (Traztuzumab): anticorpo monoclonal boqueia os receptores c-ERBB2 (Her-2/neu) em câncer de mama metastático • Gefitinibe (Iressa)  inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)  inibe ligação do ATP da tirosina quinase ao receptor intracelular  câncer de pulmão • Erlotinib (Tarceva) inibidor potente de EGFR  câncer de pulmão  associado a quimioterapia • Cetuximab ou C225 (Erbitux)  anticorpo monoclonal  contra sítio de ligação extracelular do EGFR  câncer de cólon • Bevacizumab (Avastin)  anticorpo humanizado  ação antiangiogênica  bloqueio do fator de crescimento endotelial vascular circulante (VEGF)  câncer de pulmão e colorretal

  43. TERAPIA ANTISENSE • TERAPIA ANTISENSE (AS): inibição da expressão de um produto gênico usando uma sequência de DNA complementar • sequência de 15-20 pb ou complementar ao mRNA inteiro  bloqueiam os fatores de iniciação da tradução ou interação do mRNA e ribossomos. SILENCIAMENTO GÊNICO Terapia do Câncer: Genes alvos  oncogenes, genes supressores mutantes e moléculas de sinalização

  44. TERAPIA ANTISENSE (AS) AS Oligos nucleases-resistentes

  45. TERAPIA ANTISENSE Aprovado em 1998 contra retinite induzida por citomegalovírus  injeção local Oligonucleotídeo antisense: VitraveneTM Vários oligos AS em triagem clínica fase III  doenças infecciosas e câncer - Ex.: Oblimersen (Genasense)  alvo gene Bcl-2 (vários tipos de câncer) C-Raf, H-Ras, c-Myc, c-Myb, TP53, VEGF ainda não aprovados pelo FDA Validação dos efeitos dos oligos AS: -imuno -Western blotting -RT-PCR Efeitos colaterais: resposta imune; coagulopatias e danos no fígado

  46. RNA interferência - miRNA -considerados como drogas que induzem apoptose e bloqueio do ciclo celular -introduzidos em vetores: adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), retrovírus, lipossomos, injeção do RNA, nanopartículas Camundongos: -miR-15a e miR-16-1: tratamento da leucêmia -família miR-29: suprimir câncer de pulmão e leucêmia (LMA) Triagem clínica: alvos -IL-10: tratamento da preeclâmpsia -VEGF e VEGFR-1: degeneração macular -BCR-ABL: LMC

  47. microRNA e Câncer • Ambros et al (1993): descobriram o gene lin-4 (small non-protein-coding RNA)  regulação do desenvolvimento de Caenorhabditis elegans • Identificação de ~1000 microRNAs (miRNAs)  20-22 nucleotídeos  não codificadores de proteínas • Reguladores negativos da expressão gênica • Regulam >30% de RNAm: função em processos como desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular, apoptose e resposta a estresse • Presentes em: C. elegans, D. melanogaster, plantas e mamíferos (humanos) • miRNA: implicados em vários cânceres humanos  tanto perda como ganho de miRNA  contribuem para o desenvolvimento do câncer

  48. Biogênese do microRNA miRNA: gerado pela transcrição de um longo precursor (pri-miRNA) processado para produzir um segundo precursor (pre-miRNA) 60-100 nucl. Transportado  citoplasma processado RNase III Ligação 3’UTR RNAm  inibição tradução miRNA final duplex http://www.gene-quantification.de/micro-rna.html#def

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