Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con l’impiego di microchip

1. Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con l’impiego di microchip Enrico Tortoli

2. Le resistenze del bacillo tubercolare • cromosomiche • sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con frequenza compresa fra 1x10-5 e 1x10-6 • selezione dei mutanti resistenti in caso di terapie incongrue

3. MDR-TB • letalità superiore al 40% • altissima incidenza nei paesi in via di sviluppo • il genotipo Beijing

4. L’antibiogramma tradizionale • metodo delle proporzioni • su Lowenstein-Jensen: 28-42 gg • su 7H10/11: 10-21 gg • in terreno liquido (radiometrico, MGIT) 5-12 gg

5. I farmaci antitubercolari maggiori • ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi degli ac. micolici • RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica • PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto • ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi della componente glucidica della parete • STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica

6. Mutazioni e resistenze • nella grande maggioranza dei ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari sono state individuate mutazioni in determinate regioni geniche • per nessun farmaco sono state trovate mutazioni associate al 100% delle resistenze • in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro

7. Isoniazide I • è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, l’attività catalasica è ridotta o assente • tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di mutazioni nel gene katG (gene della catalasi-perossidasi) • circa il 55% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene katG • l’attività battericida dell’isoniazide si manifesta soltanto in seguito all’ossidazione del farmaco operata dell’enzima catalasi-perossidasi • circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene katG mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpC codificante per una alchil-idroperossido reduttasi • l’introduzione del gene katG wild-type in mutanti isoniazide-resistenti ripristina la sensibilità al farmaco

8. Isoniazide II • circa il 30% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene inhA che codifica per un enzima coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene inhA potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide; le mutazioni sono responsabili di over-espressione del gene • mutazioni del gene kasA, codificante una proteina che regola l’allungamento degli acidi grassi, sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti. La proteina suddetta potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide • MECCANISMO DI AZIONE: inibizione della biosintesi degli ac. micolici

9. Rifampicina • oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni missense nel gene rpoB codificante per la subunità  della RNA-polimerasi • le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA

10. Etambutolo • il 50% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo presentano mutazioni nel gene embB, uno dei geni del locus emb che codifica per varie arabinosil-transferasi • le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dell’arabinano nei polisaccaridi della parete, costituiscono il bersaglio dell’etambutolo; in caso di mutazione si ha over-espressione

11. Pirazinamide • la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi • oltre l’80% dei ceppi pirazinamide-resistenti presentano mutazioni nel gene pncA codificante per la pirazinamidasi

12. Streptomicina • alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rpsL che codifica per la proteina ribosomiale S12 • altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S • le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dell’antibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica • nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistentI

13. Metodi genotipici di ricerca delle resistenze • ricerca delle mutazioni associate con le resistenze • sequenziamento genico • Single Strand Conformation Polymorphism • Restriction Fragment Lenght Polymorphism • ibridizzazione in fase solida • formazione di eteroduplex • tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazioni

14. Microarray • sistemi miniaturizzati in cui su un supporto solido sono immobilizzate, legate alle singole postazioni di una matrice, catene di ac. nucleico • microchip: microarray commerciale, preconfezionato, in cui le singole postazioni possono, o meno, essere controllate elettronicamente • identificazione, in fasi successive, delle eventuali mutazioni presenti in una determinata regione geniche di vari ceppi (amplicon down) • identificazione di una specifica mutazione in molti ceppi contemporaneamente (capture down)

15. Amplicon down • mancata ibridizzazione = probabile resistenza, da confermare cimentando in successione sonde con differenti mutazioni fino al raggiungimento dell’ibridazione (possibilità di usare coppie di sonde marcate con differenti fluorocromi) • legame, a vari microelettrodi, degli amplificati della regione in esame ottenuti da altrettanti ceppi • aggiunta di una sonda wild-type marcata • ibridizzazione = sensibilità impiego di numerose sonde per ciascuna regione da monitorare

16. Capture down • legame ai vari microelettrodi di varie sonde, ciascuna specifica per una diversa mutazione della regione genica di interesse • aggiunta dell’amplificato in esame • aggiunta di una nuova sonda (marcata), specifica per un tratto privo di mutazioni della regione amplificata • rivelazione dell’amplificazione grazie alla marcatura impiego di numerosi microelettrodi per ciascuna regione da monitorare

17. Eteroduplex • legame, a ciascun microelettrodo, dell’amplificato di un ceppo in esame • aggiunta di una sonda wild-type • aggiunta una proteina di E. coli, implicata nei meccanismi di riparazione del DNA, che ha la caratteristica di legarsi alle doppie catene di ac. nucleico che presentano mismatch • legame = eteroduplex = resistenza • assenza di legame = duplex omogeneo = sensibilità impiego di una sola sonda e di un singolo microelettrodo per ciascuna regione da monitorare

18. Conclusioni • la determinazione genotipica delle resistenze permette di ottenere risultati con un mese di anticipo rispetto ai metodi tradizionali • i microarray sono attualmente l’unica tecnologia con potenzialità di monitorare l’intero spettro delle mutazioni associate a resistenze nel bacillo tubercolare • la sensibilità genotipica deve sempre essere confermata dal test fenotipico • false sensibilità: in caso di resistenze non associate a mutazioni note • false resistenze: in presenza di una proporzione di mutanti resistenti al disotto della soglia del 1%