T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos

1. T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos

2. Objetivo: Diseño deoligonucleótidos adecuados para la amplificación mediante PCR de un fragmento interno del gen rpoS en Ps. alcaligenes

3. RpoS o S Genes que confieren resistencia al estrés, genes involucrados en re-arreglos morfológicos y genes que provocan cambios en el metabolismo celular RpoS Estrés: ayuno en nutrientes, pH ácido, alta osmolaridad

4. Procedimiento • En base de datos de secuencias proteicas buscar secuencias correspondientes a RpoS de Pseudomonas. • Elegir 4 de estas secuencias y armar con ellas un archivo en formato FASTA • Buscar las regiones de homología utilizando el ClustalW

5. ClustalW

6. Procedimiento 4) Elegir regiones de homología situadas a una distancia adecuada (50 aa = 150 nucleótidos) 5) Reconstruir la secuencia nucleotídica de los nucleótidos elegidos, teniendo en cuenta los diferentes codones para un mismo aminoácido y el uso de codones para P. alcaligenes

7. Ejemplo • Secuencia aminoacídica elegida • PDA(A o E)WDG 2) Reconstrucción de secuencia nucleotídica

8. A (Ala) R (Arg) N (Asn) D (Asp) C (Cys) Q (Gln) E (Glt) GCA GCC GCG GCT CGA CGC CGG CGT AGA AGG AAC AAT GAC GAT TGC TGT CAA CAG GAA GAG G (Gly) H (His) I (Ile) L (Leu) K (Lys) M (Met) F (Fen) GGA GGC GGG GGT CAC CAT ATA ATC ATT CTA CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG ATG TTC TTT P (Pro) S (Ser) T (Thr) W (Trp) Y (Tyr) V (Val) CCA CCC CCG CCT TCA TCC TCG TCT AGC AGT ACA ACC ACG ACT TGG TAC TAT GTA GTC GTG GTT Código genético

9. Codon usage para P oleovorans

10. AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGlnGATGAAGGTTTTCTTTCTTATTGTTGGCTTCCTCATCAA  C  G  C  CT CAGC  C  C   T C  C  C  G         A     A  A           A  A          G     G  G           G  G Elegir la region de 18 a 21 nucleotidos menos “degenerada” Un total de 32 oligonucleotidos se generan para dar lugar al peptido . TATTGTTGGCTTCC TACTGTTGGCTTCC TATTGCTGGCTTCC TACTGCTGGCTTCC etc.

11. Nomenclatura para nucleótidos degenerados Nucleótidos degenerados: B = C ó G ó T D = A ó G ó T H = A ó C ó T K = G ó T M = A ó C N = A ó C ó G ó T R = A ó G S = G ó C V = A ó C ó G W = A ó T Y = C ó T Nucleótidos complementarios C – G A - T B – V D - H K – M N - N R – Y S – S W –W

12. Para diseñar primers • Tamaño del oligonucleótido y del producto • Temperatura de fusión (Tm) • Especificidad • Secuencias complementarias • Contenido en G/C y cadenas de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G) • Secuencia 3’ terminal. • Secuencia 5’ terminal y regiones centrales

13. Tamaño del oligonucleótido 18 a 24 bases Temperatura de fusión (Tm) Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Tann: 5- 8 °C más baja que la de fusión

14. Contenido en G/C 45% al 55% Ideal mezcla al azar un contenido en GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm estaría en el rango de 56°C – 62°C). • Complementariedad NO estructuras secundarias o dímeroso doble cadena • Secuencia 3’-terminal CG Clamp • Secuencia 5’-terminal y regiones centrales CG Clamp

15. Temperatura de fusión (Tm) TmForward = TmReverse Tm = 55-62ºC T hibridación ~ 5-8ºC menos que la Tm Tamaño del primer 12-30 b, óptimo 18 a 24 b Distancia entre primers 10 b-10 kb Contenido en G+C >= secuencia diana; ideal del 45% al 55% “cepo GC” en 3’ termina en T; G o C en dos (máx.) de cinco últimas bases “cepo GC” en 5’ incluir varias G o C en las últimas bases Lugares de apareamiento de de primers únicos Resumén de Criterios “positivos” para el diseño de primers

16. Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Online

17. http://molbiol-tools.ca/PCR.htm

21. Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Uso del programa DNAMAN