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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA

ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA. Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados

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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA

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Presentation Transcript

  1. ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados La secuencia de una proteína es similar entre especies pero no es idéntica Las proteínas han evolucionado mediante cambios en sus secuencias de aminoácidos. Algunos cambios son conservadores y otros no conservadores

  2. Método experimental (Actualmente existen secuenciadores automáticos) • 1ª Fase: Determinar la composición de aa • Hidrólisis ácida • Cromatografía DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UNA PROTEÍNA: SECUENCIACIÓN 1953: Sanger secuenció la insulina 2ª Fase: Identificar el aa N-terminal Marcar el aa N-terminal 1-fluor-2,4 dinitrobenceno (DNF) (der. amarillo) Cloruro de dansilo (ClDNS) (Der. Fluorescente) Hidrólisis del péptido Separación de aa (electroforesis, cromatografía) Identificación del aa marcado

  3. Identificación del residuo C-terminal • Hidrazina (NH2-NH2): rompe enlaces peptídicos y forma derivados de hidrazina con todos los aa excepto el C-terminal • Carboxipeptidasa A: hidroliza el último enlace peptídico • 3ª Fase: Degradación de EDMAN • Marcar el aa N-terminal con fenilisotiocianato (PITC) en medio alcalino (se forma el derivado feniltiocarbanilo) • Se hidroliza el enlace peptídico entre los residuos 1 y 2 • (medio ácido anhidro fuerte) • Se identifica el derivado del residuo N-terminal por HPLC • El resto del polipéptido sigue intacto por lo que puede repetirse el proceso para determinar el 2º aminoácido • Por repetición continuada puede secuenciarse el polipéptido desde el extremo N-terminal

  4. Después de la hidrólisis Amarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis ionizados no se extraen) Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo DNS-Cl Cloruro de dansilo Después de la hidrólisis Análogo a FDNB pero fluorescente (detecta cantidades mínimas) Reactivos para identificar NH2 terminales 2,4-dinitrofluorbenceno FDNB Sanger

  5. Hidrazinolisis NH2-NH2 Después de la hidrólisis NH2-NH2 El terminal queda libre y los demás como hidracidas Reactivos para identificar COOHterminales

  6. Marcaje 1ª vuelta Liberación Marcaje 2ª vuelta Liberación DEGRADACIÓN DE EDMAN “Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko Ed. Reverté, S.A. 2003

  7. SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

  8. “Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002

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