应用 AFLP 技术分析植物基因组

1. 生物学综合大实验之 应用AFLP技术分析植物基因组

2. 实验目的： 1、掌握植物基因组DNA的提取方法 2、了解AFLP的实验原理、操作过程及其应用

3. 实验内容 1　植物基因组DNA的提取 2 　植物基因组DNA的AFLP操作及结果分析

4. 实验原理： 我们都知道世界是多姿多彩的，可以说是五彩斑斓，花样百出，无奇不有！从生物学这个角度来看，这到底是什么原因呢？

5. 主要是因为生物具有多样性 ！！？？ • 生物的多样性主要包括四个层次即：遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性。 • 而遗传多样性是其它多样性的基础，也可以说，生物多样性归根到底就是遗传多样性。 • 那么遗传多样性又是如何检测的呢？

6. a.多态性高； b.共显性遗传，在二倍体的生物中能区分纯合与杂合状态； c.在基因组中频繁出现，甚至贯穿分布于整个基因组； d.选择中性； e.容易获得； f.容易操作，自动化程度高； g.重复性好； h.所得数据可在实验室之间交流和比较 • （1）形态学标记 • （2）细胞学标记 • （3）生化标记 • （4）分子标记

7. 分子标记的历史： • 第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） • 第二代分子标记技术RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA ） • AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） • 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性) 等

8. AFLP（Amplidied Fragment Length Polymorphism）是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。 基本原理是基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一些带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。结果只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。

9. 引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1—10 bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。

10. AFLP的实验流程 • 模板制备 • DNA的提取（SDS法和CTAB法） • 酶切 • 连接 • PCR扩增(PCR AMPLIFIED ) • 预扩增(Pre-amplified) • 选择性扩增(Elective amplified)

11. 扩增产物凝胶电泳 扩增片段通常用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据扩增片段大小范围选择应用4%一10%的凝胶电泳。 • 结果分析 应用放射自显影、银染、荧光测序仪等方法显示结果，通过Gene-Scan, Gel-Compare等软件进行数据分析。

12. DNA的提取（SDS法和CTAB法） • SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为十二烷基磺酸钠， • CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨， • 两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出来，另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

13. 酶切 • 为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个用6个碱基识别位点的限制性内切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI )，另一个用4个碱基识别位点的限制性内切酶(常用MseI 、TaqI)。采用双酶切的主要原因有：(1)多切点酶产生较小的DNA片段，而切数点较少的酶能够减少扩增片段的数目，因为扩增片段主要是多切点酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样就可以减少选择扩增时所需要的选择碱基数。(2)双酶切可以进行单链标记，从而防止形成双链造成的干扰。(3)双酶切可以对扩增片段数进行灵活调节。(4)通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。这样，经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技术革新成功的关键在于DNA的充分酶切，所以对模板质量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物质存在。

14. 连接 • 酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用下与两种内切酶相应的特定接头相连接，形成带接头的特异性片段。接头为双链，由两部分组成，一部分是核心序列，一部分是酶特定序列(能与酶切片段粘端互补)，通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识别位点的碱基，保证了连接片段不能再被酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的接头才能得到满意的扩增结果。

15. PCR扩增(PCR AMPLIFIED ) • 应用与接头相识别的引物进行扩增。AFLP引物由三部分组成：（1）5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence)（2）限制性内切酶特定识别序列(enzyme-specific sequence) （3）3′端的带有选择性碱基的粘性末端(selective extension)，其中AFLP接头的设计(包括核心序列和酶特定序列)是关键之处，常用的多为EcoRI和MseI接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过94℃变性，37℃退火，4℃保存备用；理论上每增加一个选择性碱基，将只扩增限制性片段的1/4，而在两个引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得1/4096的片段；也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制酶切片段被扩增。所以选择性碱基是选择用于扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法；

16. 预扩增(Pre-amplified) • 扩增所用引物3′端有一个选择碱基，通过预扩增对扩增模板进行初步筛选，一方面可以避免直接扩增造成的指纹带型背景拖尾现象，另一方面可以避免直接扩增由引物3′端3个选择碱基误配形成的扩增产物。 • 选择性扩增(Elective amplified) • 预扩增产物经稀释后进行选择性扩增，使所需模板量不受限制。所用引物3′端有3个选择碱基的延伸，通过3个选择碱基的变换获得丰富的DNA片段。

17. Mse I EcoR I （限制性内切酶） （连接） EcoR I接头 Mse I接头 EcoR I引物+A Mse I引物+C （预扩增） EcoR I引物+AAC （选择扩增） Mse I引物+CAA （电泳检测）

18. 实验步骤： 1 植物基因组DNA的提取 2 DNA被限制性内切酶切割 3 与AFLP聚核苷酸接头(adapter)连接； 4 利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg； 5 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段； 6 银染。

19. 利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。所以说AFLP技术是一种新的且功能强大的DNA指纹技术。利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。所以说AFLP技术是一种新的且功能强大的DNA指纹技术。

20. 实验材料： 留兰香组培苗 实验主要仪器： PCR仪 高速离心机 电泳仪 DNA序列测定电泳槽 凝胶成像系统等

21. 实验方法与过程 1　引物和接头(adapter)合成    引物和接头合成是AFLP技术中重要的步骤，引物和接头的改进是AFLP较RAPD、PCR最主要的变革。　　引物可通过DNA自动合成仪人工合成，AFLP引物的设计主要由接头的设计决定，AFLP引物的一个重要特征是所有引物起始于5′残基，5′端是与接头序列相对应的。　　引物主要由3部分组成：①核心序列(CORE)；②酶特异序列(ENZ)；③选择性延伸序列(EXT)。

22. 如EcoRI引物和MseI引物(EXT用NNN表示，N表示任何碱基)如EcoRI引物和MseI引物(EXT用NNN表示，N表示任何碱基)

23. 接头一般由二部分组成：核心序列和酶特异序列，接头一般由二部分组成：核心序列和酶特异序列， 如EcoRI接头和MseI接头：EcoRI-adapter: 5-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5MseI-adapter:5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5

24. 2　模板DNA制备 DNA提取,双酶切,接头连接　 扩增反应中的模板DNA可以用基因组DNA也可以用cDNA。 首先，采用CTAB法提取植物基因组DNA，然后双酶切目 的DNA，如EcoRI/MseI两种酶。然后用T4 DNA连接酶，将EcoRI和MseI接头与酶切片段连接起来，连接后，稀释10倍，-20℃贮存。则模板DNA可用于扩增反应。 AFLP反应对模板DNA浓度不是很敏感，在25ng甚至25pg时，均可以观察到多态性带，但为了实验的准确性，DNA浓度不能太低，而且模板DNA最好纯一些，以防干扰实验。

25. 3DNA扩增反应AFLP扩增一般使用二对引物，扩增的条件依赖于AFLP引物的选择性核苷酸的性质，扩增反应需经过几十次循环。3DNA扩增反应AFLP扩增一般使用二对引物，扩增的条件依赖于AFLP引物的选择性核苷酸的性质，扩增反应需经过几十次循环。 当引物无或有一个选择性核苷酸时，AFLP只需20个循环，每一次循环分为以下几步：94℃，DNA样品变性30秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。 当引物有2或3个选择性核苷酸时，AFLP反应是36个循环。第1个循环是：94℃DNA变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟；第2到13个循环，DNA退火温度每次递减0.7℃，其余步骤同第一个循环；第14～36循环，退火温度是56℃，其余步骤同第一个循环 。

26. 对于复杂基因组DNA，AFLP扩增不同于简单基因组，要分两步进行，即第一步是预扩增，用一对AFLP引物，AFLP引物只有一个选择性核苷酸，扩增后，反应混合物稀释10倍，DNA用作模板，进行第二次扩增对于复杂基因组DNA，AFLP扩增不同于简单基因组，要分两步进行，即第一步是预扩增，用一对AFLP引物，AFLP引物只有一个选择性核苷酸，扩增后，反应混合物稀释10倍，DNA用作模板，进行第二次扩增 第二次扩增的引物是具有3个选择性核苷酸的引物。两步法有以下好处，一是可减少“Smear”背景污染；二是可为AFLP反应提供大量的模板DNA。

27. 4 制胶 测序凝胶板的制备 玻璃板的处理：银染测序的玻璃板一定要非常清洁。实验过程中，先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高。每次铺胶前均需分别严格处理长玻璃板和短玻璃板。

28. （1）长玻璃板的处理a) 用浸透亲和硅烷溶液(1ml左右)的镜头纸擦拭清洗过的长玻璃板。长玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上；b) 五分钟后用吸水棉纸沾95%乙醇洗长玻璃板3次，以除去多余Sigmacote溶液。 （2）短玻璃板的处理a) 更换手套，避免与亲和硅交叉污染；b) 用浸透剥离硅烷溶液(1.5ml)的镜头纸擦拭清洗过并已经自然干燥的整个玻璃板板面；c) 五分钟后，用干净纸头单向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次,每次均须换用干净的纸，以除去多余的粘合溶液；d) 实验中根据温度等实际情况调整剥离硅烷的涂量。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。

29. （3）测序板处理的注意事项 • 在单向擦玻璃板时不要过度用力,否则会带走过多粘合硅烷,使凝胶不能很好地粘附； • b) 一定要更换手套，防止粘染粘合硅烷,否则将导致凝胶撕裂； • c) 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡30～60min后除去； • d) 为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。

30. 凝胶的制备：（1） 固定玻璃板用0.4mm厚的边条置于长玻璃板左右两侧，将短玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。 （2）制备测序凝胶(6%)先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后再加过硫酸铵和TEMED。

31. 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)由丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。在凝胶聚合中，丙烯酰胺单体分子中的双键先打开，相互连接形成脂肪族长链分子，再由交联剂亚甲基双丙烯酰胺随机地与长链上的游离功能机团反应，构成三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶(PAG)由丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。在凝胶聚合中，丙烯酰胺单体分子中的双键先打开，相互连接形成脂肪族长链分子，再由交联剂亚甲基双丙烯酰胺随机地与长链上的游离功能机团反应，构成三维网状结构的凝胶。 打开丙烯酰胺双键必需的自由基由引发剂过硫酸铵(APS)提供。凝胶聚合反应的催化剂为四乙基乙二胺 (TEMED)。

32. （3）灌制胶板将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。（3）灌制胶板将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。

33. 4）凝胶制备过程中的注意事项 a) 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。b) 溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。c) 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。

34. 5　凝胶电泳　　扩增反应结束后，热变性,低温冷却,每个DNA样品取2μl，在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，在常压、110W下，电泳2小时5　凝胶电泳　　扩增反应结束后，热变性,低温冷却,每个DNA样品取2μl，在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，在常压、110W下，电泳2小时

35. 预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（本实验中采用常规的梳子，不必如此）预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（本实验中采用常规的梳子，不必如此） （2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。 （3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。 （4）先将水浴加热至55℃后进行预电泳。 （5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟（恒功率80-90W,约30min）。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响实验的结果。（6）预电泳的注意事项a) 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果；b) 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪；c) 厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。

36. 上样及电泳（1）关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素。上样及电泳（1）关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素。 （2）PCR扩增产物:甲酰胺上样液（98%甲酰胺，10mmEDTA，0.25%溴酚兰,二甲苯菁）8:3混合，95℃变性8min，然后立即冰浴。如果样品长时间不用，则应重新处理。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。AFLP选择性扩增产物95℃变性8min，然后立即冰浴。 （3）立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，0.4mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。(4)结束电泳 待二甲苯菁至三分之二玻璃板长度处,停止电泳.

37. 6 银染或放射自显影 得到被扩增的DNA谱带，通过比较即可找出不同样品 DNA谱带的差异。 银染的原理 是利用银离子(Ag+)渗入凝胶中与DNA分子结合成稳定的复合物。 然后在碱性条件下，用甲醛作为还原剂使金属银析出，呈现黑褐 色银沉淀而现显出DNA分子条带。

38. 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 （1）电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在长玻璃板上。 （2）固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定溶液（醋酸溶液）浸没,充分振荡20分钟或至样品中染料完全消失，胶可在固定溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定溶液，用于终止显影反应。 作用使胶转化为酸性状态,银离子好与DNA结合 该步骤不足,会使硝酸银结合的特异性降低,造成染色本底过高,故胶色发深 。 （3）洗胶：用超纯水振荡洗胶2次，每次8分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽，再进行下一次洗涤。

39. (4）凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。(4）凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 • (5) 显影 • 显影液的配制：在已冷却至10℃的碳酸钠溶液(或NaOH)中，加入37%甲醛(3ml)和10mg/ml的硫代硫酸钠溶液(400μl)。往染色盘中倒入预冷的反应液1升，放在一边，其余反应液仍放在冰浴中。 • b) 胶从染色液中取出，放在一边，染色液回收到烧杯中，盘清洗后加入超纯水。 • c) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复用染色液浸泡处理。 • d) 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的显影液中继续显影2-3分钟,或直至所有条带出现。 • e) 终止显色反应：弃掉显色液，加入1升终止溶液，摇床反应2－3分钟，停止显影反应,固定凝胶

40. 植物基因组 DNA的提取 质量检测 结果分析 双酶切 银染 实验总体过程示意图 接头连接 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 预扩增 制胶 稀释 选择性扩增

41. 注意事项: 1. DNA提取的过程中动作要轻柔,不可破坏基因组 2. 提取的DNA纯度要高,OD>1.7, 3.双酶切时,要注意每个公司提供的buffer, 4.酶切后要及时连接效果比较好, 5.制胶时亲和硅烷涂布要均匀,否则粘板,无法统计结果; 6.染色时要把握时间的尺度,过短带型不清晰,过长胶板变黑,无法统计; 7.最后胶板的冲洗要充分,否则无法保存

42. AFLP技术的改良 • 内切酶的应用 • 有多种内切酶组合如EcoRI、PstI、 SacI、 HindIII或Apal与MseI、 TaqI用于AFLP技术 • 只应用一种内切酶制备模板（单酶切） • 也有应用三种内切酶的报道（三酶切）TE-AFLP • 引物的标记及结果显示 • 引物标记已从同位素标记发展到目前的荧光标记，荧光标记减少了同位素对人体的损害，同时使结果分析更加便利准确，但费用仍然很高，单酶切AFLP法的引物不需要标记，只需通过琼脂糖凝胶电泳、紫外透射仪观察结果，省时、方便，但溴化乙锭对人体有危害。现有一种银染法可以降低成本又对人体无害，但操作相对复杂繁琐又费时。 • 其它类型 • AFLP技术是基于对基因组DNA的分析而创建的，目前已有cDNA-AFLP，还有甲基化敏感-AFLP 。

43. AFLP技术的应用 遗传作图 利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记 AFLP辅助的轮回选择育种 利用AFLP技术研究基因表达与调控 分类和进化研究 DNA甲基化分析

44. 作业： 预习报告： CTAB法提取植物基因组DNA的过程 AFLP的原理及应用

45. 归档材料 1 预习报告 2 实验报告 3 实验考试试卷

46. 实验报告内容： 1 学生姓名、学号、实验组号、实验日期(08.12.10)、指导教师等基本信息 2 实验题目 3 实验目的 4 主要实验仪器及材料 5 实验原理 6 实验的主要内容、方法和步骤 7 实验的基本数据、图形 8 实验数据、图形的分析、处理及结果 9 思考与讨论 主要对实验中存在的问题、进一步的想法等进行讨论