L’impiego della DFF nella separazione cellulare.

1. L’impiego della DFF nella separazione cellulare. Murgia R., Maxia N., Puddu B., Ortu, S., Caredda E., Brotzu G. Dipartimento di Chirurgia e Scienze Odontostomatologiche Università degli Studi di Cagliari Cattedra di Chirurgia Vascolare, Laboratorio di Colture Cellulari Introduzione Negli ultimi anni i nostri studi si sono focalizzati sull’isolamento di cellule staminali CD 34+ da sangue placentare o da sangue midollare suino, nella differenziazione e messa in coltura di queste cellule e nella applicazione nel campo della ricerca clinica. Le metodiche per isolare questa linea cellulare a scopo di ricerca risultano essere attualmente molto laboriose e costose, fra le più diffuse ricordiamo l’utilizzo di anticorpi monoclonali (biglie magnetiche Dynal CD 34+). Attualmente stiamo mettendo appunto una tecnica per la separazione cellulare su base dielettroforetica sfruttando la capacità delle cellule di migrare in un campo elettrico creato dall’applicazione di una differenza di potenziale. L’apparecchio utilizzato prende il nome di DFF-30 (Dielectrophoretic Flow Fractionation System). • Il sistema DFF-30 è costituito da una camera di separazione dotata alle estremità di due porte: • la prima (in ingresso) collegata al sistema di iniezione • la seconda (in uscita) per la raccolta del campione. • La camera è dotata nel suo interno di una lastra magnetica nella quale viene creato un gradiente elettrico per mezzo di due elettrodi collegati ad un generatore di corrente. La gestione della frequenza e dell’amperaggio avvengono per mezzo di un software collegato al sistema. Schema apparecchio DFF Materiali e metodi La camera dielettroforetica viene riempita con una soluzione isotonica costituita da sucrosio all’8.5%, destrosio allo 0.3% ed IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco Medium ) avente conduttività di 200 mS/m . Il campione da separare viene diluito 1:3 con soluzione fisiologica, e stratificato su gradiente di densità con 10 ml di Ficoll per poi essere centrifugato per 20 minuti a 2100 rpm. Il campione viene iniettato nella camera e verrà fatto diffondere per 6 minuti ad una frequenza di 10.000Hz e per 2 minuti ad una frequenza di 40.000Hz con un voltaggio di 2,90 V. A questo punto la soluzione di eluizione viene fatta scorrere all’interno della camera con un flusso di 90 ml/min. partendo da una frequenza di 110.000 Hz con voltaggio di 2.5 V per circa 20 minuti, fino ad arrivare a frequenze di 70.000Hz raccogliendo sempre il campione dalla porta in uscita. Risultati I dati ancora provvisori della microscopia ottica e della citofluorimetria attualmente ci permettono di affermare che la maggior concentrazione di cellule CD 34 +sono rappresentate ad una frequenza compresa fra gli 85.000Hz e gli 80.000Hz. • Conclusioni • Nonostante i nostri studi siano ancora in corso, possiamo anticipare alcune considerazioni: • il DFF-30 permette una separazione cellulare in tempi più brevi e con costi contenuti rispetto alle tecniche attuali • Questa metodica potrebbe essere utilizzata non solo per l’isolamento di cellule CD 34 + ma per isolare tutte le linee cellulari (es. cellule delle insule pancreatiche) • Si potrebbe arrivare all’utilizzo del DFF-30 non solo per scopi di ricerca ma anche per poter poi reimpiantare le cellule ottenute su pazienti (es. campo dei trapianti da staminali).