Nouvelles stratégies pour faire face à la résistance des bactéries aux antibiotiques

1. Projet Génie Biologique Troisième Année Nouvelles stratégies pour faire face à larésistance des bactéries aux antibiotiques Laurent Guillaud Fabienne Le Bouteiller Céline Martineau Hélène Mauboussin Alain Medawar Jian-Chun Sun Romain Viaux-Cambuzat Chef de projet : Fabienne Degroote

2. Introduction Introduction Nouvelles stratégies pour faire face à la résistance des bactéries aux antibiotiques • Un problème d’actualité • Recherche de solutions techniques • Aspects industriels et perspectives

3. Introduction Introduction • Objectifs de la soutenance • Apporter une vision complémentaire • Mettre en évidence les enjeux • Sommaire • Evaluation d’un agent anti-microbien • Un exemple: les peptides anti-microbiens • Développement et Mise en application dans la société moderne

4. Introduction Évaluation d’un agent anti-microbien Différents critères pris en compte Comparatif  des stratégies Peptides anti-microbiens Types et Modes d’action Origines et Motivations Exemples d’organismes Techniques rapides d’identification microbienne Mise en application et rôle de l’État Entomed Rôle de l’État dans l’aide aux entreprises innovantes Influence de l’État sur la population Conclusion Plan

5. Évaluation d’un agent anti-microbien

6. Évaluation d’un agent anti-microbien Différents critères pris en compte

7. Évaluation d’un agent anti-microbien Émergence de la résistance • Adaptation de la bactérie (rôle de la pression de sélection, du mode d’action, de la largeur du spectre) Enrayée par Arrêt de prescription lors de l’apparition Limitation de prescription de produits à large spectre Hygiène

8. Évaluation d’un agent anti-microbien Largeur du spectre d’action • Définition • Ne prend pas en compte la résistance • 4 classes pour les espèces bactériennes • Espèces habituellement sensibles • Espèces modérément sensibles • Espèces inconstamment sensibles • Espèces résistantes

9. Évaluation d’un agent anti-microbien Effet • Définition Bactériostatique : Concentration Minimale Inhibitrice Bactéricide : Concentration Minimale Bactéricide Antipathogénique

10. Évaluation d’un agent anti-microbien Obtention Recherche &Développement : - Cribler l’agent anti-microbien - Modifications Production

11. Évaluation d’un agent anti-microbien Immunogénicité / Toxicité • Risque d’allergie • Utilisation de molécules de défense Toxicité potentielle chez l’homme Ex: mélittine (abeille), pardaxine (poisson)

12. Évaluation d’un agent anti-microbien Comparatif des stratégies

13. Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien

14. Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien

15. Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien

16. Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien

17. Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien

18. Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien Solution Critère

19. Évaluation d’un agent anti-microbien Bilan • Grande diversité des solutions envisagées • Chaque solution est un bon candidat • Nécessité de recherches : • Validation du produit dans le cas considéré • Mise en place d’une action planifiée et raisonnée

20. Peptides Anti-microbiens

21. Peptides Anti-microbiens Types et Modes d’action

22. Peptides anti-microbiens Généralités • Petites molécules endogènes • Effet anti-microbien à spectre étroit • Altération de la membrane bactérienne

23. Peptides anti-microbiens Mode d’action général Attraction électrostatique + + + + + Perturbation de la membrane - - - - - Insertion bioénergétique et interaction

24. Peptides anti-microbiens 3 catégories • Peptides anti-microbiens anioniques • Peptides anti-microbiens cationiques • Peptidesfragments de protéine

25. Peptides anti-microbiens Peptides anioniques • Dans les tissus pulmonaires, le foie et l’intestin grêle de bovinsetd’ovins • Complexés à du zinc, leur efficacité augmente • Mode d’action inconnu • Théorie : Zn+ Zn+ Mort Zn+ Zn+ Ribo nucléase Bactérie

26. Peptides anti-microbiens Peptides cationiques • Composition très variable • Classés en 3 catégories : • Grand nombre d ’Arginine et de Lysine • Domaine C-terminal variable : cationique anti-microbien Linéaires riches en Proline Avec cystéines stabilisantes Linéaires avec hélice 

27. Peptides anti-microbiens Peptides cationiques • Peptides linéaires avec hélice  • Amphiphiles Perméabilisation de la membrane • Exemple : Cécropine P1(intestin de porc) • Activité anti-bactérienne très rapide • Contre les bactéries Gram négatif Interaction avec phospholipides membrannaires Déstabilisation de la membrane

28. Peptides anti-microbiens Peptides cationiques • Peptides linéaires riches en Proline • Contiennent un grand nombre d ’Arg, Gly et Trp • Exemple : PR-39(intestin de porc) • Contre les bactéries Gram négatif Inhibe la NADPH oxydase des neutrophiles Toxique pour l’homme PR-39 Mort PR-39 Salmonella cholerasuis

29. Peptides anti-microbiens Peptides cationiques • Peptides avec cystéine stabilisante • Ponts disulfure Feuillets  stables • Exemple :  - défensines • Neutrophiles de certains mammifères • Stockées dans granulocytes • Contre les bactéries Gram négatif, Gram positif et virus  - défensines de volailles > 90% efficaces contre E.coli et Listéria monocytogenes

30. Peptides anti-microbiens Peptides fragments de protéines • Domaines anti-microbiens résidant dans des protéines • Produits d’une digestion enzymatique naturelle • Exemple : Lactoferricine • Dégradation partielle de Lactoferrine • Contre bactéries de la lumière gastro-intestinale Peptide anti-microbien

31. Peptides anti-microbiens Potentiel thérapeutique • Bons résultats invitro Pourraient être efficaces in vivo • 2 études avec des moutons présentant une pneumonie aïgue par Mannheimia hæmolytica Diminution de [bactéries] Réduction de l’inflammation Traitements et prévention d’infections pulmonaires • Besoins d’études plus poussées pour confirmation

32. Peptides anti-microbiens Les recherches futures • Séquençage futur de génomes d’animaux nouveaux peptides antimicrobiens Exemple : ß-défensines découvertes chez l’homme et la souris • Animaux transgéniques sources de peptides anti-microbiens • Lactoferrine de vache transgénique • Commercialisée au Japon : Alicament

33. Peptides anti-microbiens Bilan • Peptides anti-microbiens : Traitements des infections • Possibilité d’augmenterleur production chez les animaux • Utilisation de virus contenant un gène de peptide anti-microbien • Co-administration avec des vaccins

34. Peptides Anti-microbiens Origine et motivations

35. Peptides anti-microbiens Origine • Système immunitaire inné • Récepteurs spécifiques invariants • Contre motifs structuraux microbiens (LPS,…) • Système immunitaire adaptatif • Récepteurs de la super-famille des IgG • Contre tout corps du non soi • Rapidité de réponse de la voie innée • Performance des peptides anti-microbiens dans la réponse immunitaire

36. Peptides anti-microbiens Motivations : Étude phylogénique • Compréhension des mécanismes biologiques fondamentaux • Bonnes perspectives d’application thérapeutique • Présents chez tous les métazoaires et certains organismes unicellulaires Microorganismes Plantes Animaux Invertébrés Vertébrés Peptides Anti-microbiens

37. Peptides Anti-microbiens Exemples d’organismes

38. Peptides anti-microbiens Exemple 1: Les bactéries Entérobactéries - Klebsiella pneumoniæ Microcines E492 Actif contre Gram -

39. Peptides anti-microbiens Exemple 2: Les poissons Plie rouge Saumon Pleurocidine Hépcidine • Perspectives : -Transgénèse chez les poissons -Renforcement de l’état larvaire

40. Peptides anti-microbiens Exemple 3: Les annélides Sangsue Synthèse et stockage : cellules graisseuses 4 peptides Actifs contre les Gram + • Originalité : Stimulation par infection microbienne

41. Peptides anti-microbiens Exemple 4: Les mammifères Porc Synthèse et stockage : Leucocytes, cellules épithéliales + 12 peptides Spectre variable • Perspective : -Transgénèse dans la luzerne : β-défensine -Agent thérapeutique naturel pour le bétail

42. Peptides anti-microbiens Exemple 5: Les amphibiens Batraciens anoures Synthèse et stockage : Glandes granuleuses Pré-pro- dermaseptines Spectre variable • Perspectives : -Dermaseptines B et S : non toxiques pour l’homme -Synthèse chimique

43. Peptides anti-microbiens Exemple 6: Les insectes Drosophile Synthèse et Stockage : Corps gras 7 peptides Spectres spécifiques • Perspectives : -Applications sur les insectes utiles ou nuisibles -Applications thérapeutiques

44. Peptides anti-microbiens Bilan des exemples Sources multiples de peptides Étude des êtres vivants Découverte de peptides à haut potentiel thérapeutique

45. Peptides Anti-microbiens Techniques rapides d’identification microbienne

46. Peptides anti-microbiens Protocole de traitement Prélèvement Malade Identification du germe Prescription Choix du peptide anti-microbien

47. Peptides anti-microbiens Caractéristiques recherchées Rapide Simple Identification Automatisée Fiable

48. Peptides anti-microbiens Techniques rapides d’identification microbienne • Tests d’hybridation moléculaire • PCR quantitative • Cytométrie de flux

49. Peptides anti-microbiens Tests d’hybridation moléculaire Principe: hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN révélation du signal de l’hybride formé • LUMIprobe 24® (Europrobe / Euralam) Rapidité < 24h Spécificité Sonde ADN / ARNr germe ciblé Simplicité d’utilisation

50. Peptides anti-microbiens PCR quantitative Principe: amplification de l’ADN avec amorces choisies analyse quantitative • GeneSystem®(GeneSystems) GeneDisc Cycler Automate GeneExtract Extracteur d’ADN bactérien GeneDisc