1 / 19

PCR clamping – možný přístup k analýze somatických bodových mutací v K-ras genu

PCR clamping – možný přístup k analýze somatických bodových mutací v K-ras genu. Martin Beránek Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN v Hradci Králové. Konference DNA analýza IV, Praha, 24.5.2007. Bodové mutace K-ras a zhoubné tumory.

lyneth
Download Presentation

PCR clamping – možný přístup k analýze somatických bodových mutací v K-ras genu

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PCR clamping – možný přístup k analýze somatických bodových mutací v K-ras genu Martin Beránek Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN v Hradci Králové Konference DNA analýza IV, Praha, 24.5.2007

  2. Bodové mutace K-ras a zhoubné tumory pankreas 80-90% tlusté střevo 30-60% plíce 30-60% vaječníky, ledviny, varlata 0-48% děloha 20% prostata, kůže, prsa mozek, leukémie, ... 0-25% Kiaris, H. et al.: Int. J. Oncol, 1995, 7, 413-21

  3. Adenomatózní střevní polyp Metastázy kolorektálního karcinomu do jater Adenokarcinom ? U 1/3 osob růst adenomů> 1 cm K-ras

  4. Sekvence AK v konzervativní P-smyčce p21ras Kodon AK DNA 10 Gly GGA 11 Ala GCT 12 Gly GGT 13 Gly GGC 14 Val GTA 15 Gly GGC Gamblin SJ et al. Current Opinion in Structural Biology, 8, 1998, 195-201

  5. 95% normální 5% malignizace 1-2 mm

  6. Zablokovat specifické místo DNA proti amplifikaci a detekci při PCR = PCR clamping Neznačená sonda s afinitou vůči běžné sekvenci v Ki-ras genu vyšší než primer a vyšší než značené sondy CLAMP Normální sekvence genu

  7. Nejběžnější typy Locked Nucleic AcidsTM LNA oligomery - vyšší konformační stabilita - vyšší afinita ke komplementární sekvenci ( ↑ Tm) - vyšší specifičnost PCR

  8. Normální sekvence genu 5´ 3´ Primer re Flu sonda CLAMP Primer fw 3´ LC sonda 5´ 12. Mutace v kodonu 12 genu Primer re CLAMP Primer fw Flu sonda LC sonda

  9. Schéma real-time PCR s pomocí hybridizačních FRET sond G12 G12A G12D

  10. Schéma real-time PCR s optimalizovaným přídavkem LNA molekul G12D G12V G12

  11. LNA-clamping real-time PCR – odhad citlivosti metody LightCycler, hybridizační FRET sondy, exon I K-ras genu, SW480, 60 ng DNA templátu 60 ng (100%) 6 ng (10%) 0,6 ng (1%) 0,3 ng (0,5%) 0,06 ng (0,1%) 0,03 ng (0,05%) 0,006 ng (0,01%)

  12. Hodnocení testovaných metod DNA templát Cykly PCR produkt Citlivost Specifičnost ng bp ng PCR-RFLP150 35 157/143 15 (10,0%)ano Nested PCR-RFLP150 30+35 135/106 0,15 (0,1%) ne rtPCR + sekvenování60 45 164 0,06 (0,1%) ne LNA-clamp PCR (I)60 35 164 0.30 (0,5%) ano LNA-clamp PCR (II)60 45 164 0.03 (0,05%)ano

  13. Testování spolehlivosti PCR clamping • 100 vzorků kolorektálních karcinomů • Izolace DNA • rt PCR Clamping PCR-RFLP • Sekvenování • 100% shoda výsledků

  14. Populační výskyt mutací K-ras genu u osob se sporadickými nádory tlustého střeva • Studien % pozitivit • RASCAL 68 studií 2721 34 Andreyev J. 1998 • Hradec Králové I 53 34Beránek M. 1999 • Hradec Králové II 100 33Beránek M. 2006

  15. CEQ 8000, délka sekvencí < 200 nukleotidů Inject: 2,0 kV 15 sec, Separation 4,2 kV 30 min G12V G12D G12C G12S G13D

  16. Typy bodových mutací • HK II RASCAL • Pozitivita 33 (33 %) 941 (34 %) • G12D 15 (47 %) 31 % • G12V11 (34 %) 24 % • G12S 2 (6 %) 8 % • G12A 1 (3 %) 6 % • G12C 1 (3 %) 9 % • G12R 0 4 % • G13D 3 (10 %) 17 % • G13C 0 1 %

  17. Závěry • LNA clamping PCR spolehlivě identifikovala mutace v kodonech 12 a 13 • Detekční limit pro určení positivity: 0,03 ng • Materiálové náklady~ jednostupňová rtPCR • Čas odezvy: 24H DNA extrakce, 60 min PCR • Použitelnost sond: > 6 měsíců • Konfirmace výsledků a typizace sekvenováním • Potenciálně využitelný biologický materiál: nádorová tkáň, krev, stolice, sputum, moč,...

  18. Hradec Králové Pavel Jandík Bohuslav Melichar Jan Bureš Stanislav Rejchrt František Langr Karel Dědič Pardubice Lukáš Sákra Martin Šácha Miloš Rajman Karel Havlíček František Štumr Eva Soudková Poděkování

  19. Poděkování Projekt byl podpořen grantem IGA MZdr ČR č. NR-7884-3.

More Related