Chromozómová analýza – klasická a molekulárna cytogenetika

1. Chromozómová analýza sa zaoberá počtom a mikroskopickým vzhľadom chromozómov, ich segregáciou počas mitotického a meiotického delenia a vzťahom medzi úchylnými chromozómovými nálezmi a fenotypovými prejavmi (klinická cytogenetika). Prudký rozvoj tejto metódy sa datuje od roku 1956. Chromozómové poruchy predstavujú dôležitú kategóriu genetických ochorení. Významne sa podieľajú na množstve prípadov porúch reprodukcie, vrodených malformáciách, mentálnej retardácie a hrajú dôležitú rolu v patogenéze nádorových ochorení. Cytogenetické poruchy sú prítomné približne u 1% živonarodených detí, asi u 2 % tehotných žien starších ako 35 rokov (dôvod preprenatálnu diagnostiku) a u polovice spontánnych potratov v prvom trimestri. Chromozómovú analýzu vždy indikuje klinický genetik. Medzi indikácie patrí: 1. problémy rastu a vývoja: neprospievanie, oneskorený vývoj, mnohopočetné malformácie, anomálie vonkajšieho a vnútorného genitálu, mentálna retardácia, 2. narodenie mŕtveho plodu a úmrtie novorodenca: výskyt chromozómových aberácií je vyšší v prípadoch narodenia mŕtveho plodu (10%), 3. problémy s fertilitou, 4. rodinná anamnéza: v prípade chromozómových abnormalít u príbuzného prvého stupňa, 5. nádorové ochorenia, 6. tehotenstvo u žien v pokročilom veku. Chromozómová analýza – klasická a molekulárna cytogenetika * Morfológia chromozómu * Chromozómy sú nositeľmi genetickej informácie zakódovanej do molekuly DNA.Chromozóm (gréc. chroma = farba, soma = telo) je útvar v bunkovom jadre, viditeľný počas mitózy alebo meiózy, ktorý pozostáva z jednej alebo dvoch molekúl DNA a naviazaných bielkovín (nukleoproteínov). Komplex DNA-bielkovina sa nazýva chromatín.V jadre bunky, ktorá sa nedelí, sú chromozómy dlhé, vláknité (dešpiralizované), neviditeľné optickým mikroskopom, počas delenia bunky sú chromozómy špiralizované, skrátené,  hrubé, pozorovateľné v mikroskope. Počet chromozómov v bunkovom jadre môže byť diploidný (46) – u somatických (telových) buniek, alebo haploidný (23) – u pohlavných buniek. V diploidnej sade sa vyskytujú páry homologických chromozómov, ktoré majú rovnaký tvar, veľkosť, štruktúru aj funkciu. Počet, tvar a veľkosť chromozómov je stálym znakom pre určitý druh. Súbor všetkých morfologických znakov sady chromozómov v bunke sa nazýva karyotyp. chromatída Základné morfologické typy chromozómov: podľa umiestnenia centroméry * krátke ramienko (p) centroméra dlhé ramienko (q) metacentrický submetacentrický akrocentrický teloméra Chromozómové aberácie Nondisjunkcia počas bunkového delenia * Vznik mozaiky * Ako chromozómové aberácie sa označujú všetky zmeny chromozómov numerického alebo štrukturálneho charakteru, zistiteľné dostupnými cytogenetickými metódami. Vznikajú ako dôsledok mutačných procesov na úrovni chromozómov. Chromozómové aberácie môžu postihnúť autozómy alebo gonozómy (pohlavné chromozómy). Pri numerických aberáciách sa počet chromozómov líši od normálneho diploidného počtu – 46. Tieto aberácie sa delia na tri typy: polyploidiu, aneuploidiu a mixoploidiu. Ak počet chromozómov nie je dvojnásobkom haploidného počtu (23), ale je viacnásobkom ide o polyploidiu (triploidia, tetraploidia). Ak počet chromozómov zodpovedá násobku haploidného počtu, ide o euploidiu. Každý počet chromozómov, ktorý nie je celým násobkom haploidného počtu – aneuploidia. Najčastejšie ide o monozómiu (namiesto dvoch homologických chromozómov je jeden) alebo trizómiu (tri chromozómy). Aneuploidia vzniká tak, že v priebehu delenia bunky sa jeden z dvojice chromozómov stratí – anaphase lag, alebo sa chromozómy neoddelia – nondisjunkcia. Pod mixoploidiou sa rozumie prítomnosť dvoch alebo viacerých geneticky odlišných bunkových línií – chromozómová mozaika. Štruktúrne aberácie vznikajú následkom zmien štruktúry chromozómov. Predpokladom ich vzniku sú zlomy chromozómov, ktoré sa nereparujú do pôvodného stavu. Medzi najdôležitejšie štruktúrne aberácie patria: delécia: stratu úseku chromozómu, duplikácia: zmnoženie úseku chromozómu, inverzia: otočenie segmentu o 180 ˚(paracentrická – zahŕňa úsek bez centroméry, pericentrická – zahŕňa aj centroméru), translokácia: prenos určitého segment vrámci chromozómu alebo z jedného na druhý chromozóm, prstencovitý chromozóm: na obidvoch koncoch chromozómu nastanú zlomy a strata koncových oblastí, pričom zvyšok chromozómu utvorí prstenec, izochromozóm: namiesto pozdĺžneho delenia nastane priečne. Meióza I Vznik triploidie * Mozaikové tkanivo polárne teliesko Mozaicizmus spermia Nondisjunkcia vajíčko Bunkové delenie Meióza II Normálny vývoj Nondisjunkcia Gaméty Indukcia triploidie Zdravá bunka 2n - 46 Bunka s mutáciou Štruktúrne aberácie (7) delécia pericentrická inverzia duplikácia paracentrickáiinverzia translokácia prstencovitý chromozóm izochromozóm Metódy molekulárnej cytogenetiky Metódy klasickej cytogenetiky Konvenčná metóda Nevyhnutým predpokladom je získanie dostatočného počtu buniek v metafáze mitotického delenia. Dá sa to docieliť iba pestovaním buniek v bunkových kultúrach. Pestovanie buniek in vitro si vyžaduje sterilný odber materiálu, vhodné kultivačné médium, optimálnu teplotu, pH. Na chromozómovú analýzu možno využiť každý druh živých buniek, ktoré majú jadro. Najčastejšie sú to bunky periférnej krvi, fibroblasty, bunky plodovej vody. Na získanie dostatočného počtu buniek je nutné zablokovať mitózu v metafáze. Preparáty sa musia fixovať a farbiť. Vhodné mitózy sa sfotografujú, chromozómy sa vystrihnú a roztriedia v závislosti od svojej veľkosti a uloženia centroméry podľa Denverskej klasifikácie. Prúžkovacie metódy Flourescenčné metódy: Ich princíp spočíva v tom, že určité floureskujúce látky majú špecifický vzťah k niektorým úsekom chromozómov a viažu sa na ne. V prechádzajúcom ultrafialovom svetle možno vo flourescenčnom mikroskope na takto sfarbených chromozómoch pozorovať rozdielne intenzívne a rozlične lokalizované floureskovanie týchto častí. Docieli sa tak utváranie prúžkov na chromozómoch, ide o Q-farbiace metódy a získame Q-prúžky. Ďalšie prúžkovacie metódy: C-farbiace metódy a nimi vytvorené C-prúžky dokazujú centromerický konštitutívny heterochromatín. G- prúžky získame pomocou Giemsovho farbiva. Ide o najčastejšie používanú metódu. Každý chromozómový pár sa zafarbí charakteristickým spôsobom v podobe svetlých a tmavých pruhov. R-prúžky: ak sú chromozómy vystavené pred sfarbením špecifickým vplyvom (zahrievanie), majú výsledné tmavé a svetlé pruhy opačné (reverzné prúžkovanie) ako G alebo Q-prúžky. Rozvoj metód molekulárnej cytogenetiky sa uskutočnil zavedením technológií rekombinantnej DNA do cytogenetiky. Základnou metódou je hybridizácia in situ (ISH). DNA v metafázových chromozómoch fixovaných na sklíčkach denaturuje na mieste (in situ), čím sa stáva jednovláknová a prístupná pre hybridizáciu so značenou sondou na základe komplementarity. Na detekciu chromozómových aberácií sa používajú tri druhy sond: sondy pre špecifické chromozómové štruktúry, pre špecifické sekvencie DNA a celochromozómové sondy. Aby sondy a tým i komplementárny úsek DNA bolo možné vizualizovať, musia sa sondy značiť. Pôvodne sa používali rádioizotopy, neskôr nerádioaktívne značenie. Najčastejšou metódou je značenie pomocou fluorescenčných farbív. Lokalizácia fluorescenčného signálu a cieľovej sekvencie DNA sa pozoruje pod fluorescenčným mikroskopom. Táto metóda je známa ako fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH). Komparatívna genómová hybridizácia sa používa na meranie rozdielov v počte kópií alebo dávky konkrétneho chromozómového úseku u dvoch rôznych vzoriek DNA. Jej podstatou je vyhodnotenie intenzity signálu vzoriek DNA. Kombináciou rôzne označkovaných sond je možné farebne odlíšiť každý pár autozómov i gonozómy použitím piatich flourochrómov, čo umožňuje zistiť pri jedinom vyšetrení všetky prestavby s citlivosťou 1 mb – ide o multifarebnú FISH. RX - FISH je metóda, ktorá spája tradičné prúžkovanie s farebnou klasifikáciou chromozómov. Chromozómová analýza plodu štandardným G-prúžkovaním. Ide o mužský karyotyp s chromozómovým materiálom neznámeho pôvodu na krátkom ramene chromozómu 9. (1) FISH analýza centromér (2) Fluorescenčná in situ hybridizácia (4) Neznámy chromozómový materiál FISH Fluorescenčne značená sonda Chromozómová DNA Multifarebná FISH ukazuje, že materiál pochádza z chromozómu 2. Karyotyp pacientky s Downovým syndrómom, trizómia 21 (6) Normálny karyotyp muža – 46, XY (konvenčná metóda, farbenie Giemsovým farbivom) (5) Materiál z chromozómu 2 žena muž RX-FISH znázorňuje, že chromozómový materiál neznámeho pôvodu pochádza z distálnej časti krátkeho ramena chromozómu 2. Distálny 2p chromozómový materiál muž žena FISH so sondami špecifickými k pohlavným chromozómom (X alebo Y) (3) Detekcia telomér na koncoch každého chromozómu metódou FISH využitím repetitívnej sondy TTAGGG (2) • *Obrázky: www.google.com • www.aicorp.com • www.chrombios.com • www.mun.ca/biology • learn.genetics.utah.edu 5. www.transgenomic.com 6. www.aippg.com 7. www.embryology.ch