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La chromatographie analytique :

La chromatographie analytique :. Phénomènes physico-chimiques liés à la séparation chromatographique. A. Van Camp. Plan Général. Les forces intermoléculaires Solvants usuels en LC Phases stationnaires usuelles en GC Les phases stationnaires polaires en LC

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Presentation Transcript

  1. La chromatographie analytique : Phénomènes physico-chimiques liés à la séparation chromatographique. A. Van Camp

  2. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  3. Les forces intermoléculaires en jeu Les partenairesde la séparation Phase stationnaire = PS (parfois appelée support) Phase mobile = éluant = PM GC : gaz LC : liquide Les constituants du mélange à séparer = m1, m2, ...

  4. Les forces intermoléculaires en jeu > 0 0 < 0

  5. Les forces intermoléculaires en CL Equilibrechromatographique : En chromatographie liquide : Force intermoléculaire Force intermoléculaire

  6. Les forces intermoléculaires en GC Seule force intermoléculaire en jeu PM = N2, He, H2

  7. Les forces intermoléculaires Forces de dispersion de London : Molécules apolaires d+ d- d+ d- • attraction entre dipôles instantanés • interaction présente dans tous les composés • n'intervient qu'à très courte distance • importance augmente avec la polarisabilité du nuage électronique

  8. Les forces intermoléculaires en jeu Forces de Keesom : attraction entre dipôles permanents d- d+ d- d+ d- d+ Molécules polaires d+ d-

  9. Les forces intermoléculaires en jeu Forces de Keesom : attraction entre dipôles permanents n'intervient qu'à très courte distance Forces de Debye : attraction entre dipôle instantané et dipôle permanent n'intervient qu'à très courte distance

  10. Les forces intermoléculaires en jeu X et Y = F, O ou N donneur • Pont Hydrogène : • attraction de type Keesom entre un H lié à un atome électronégatif et un autre atome électronégatif. • interaction possible à plus longue distance accepteur

  11. Les forces intermoléculaires en jeu • Molécules apolaires : • toutes les liaisons unissent des atomes d'électronégativités similaires (C et H) • pas de dipôle permanent • seule force intermoléculaire : London

  12. Les forcesintermoléculairesen jeu • Molécules apolaires : • il existe des atomes d’électronégativité différentes, mais il n’y a pas de dipôle permanent à cause de l’arrangement symétrique. • exemple : le CCl4 d- d+ d- d- d-

  13. Les forces intermoléculaires en jeu • Molécules polaires : • contiennent des liaisons entre atomes d'électronégativités assez différentes (C-O, C-N, O-H, N-H, …) • présence de dipôle permanent • forces de Keesom, Debye et London • éventuellement : ponts H

  14. Les forcesintermoléculairesen jeu • Attraction électrostatique entre ions de signe contraire • Energie de « liaison » d’autant plus grande que le milieu est peu polaire (faible constante diélectrique) • Se rencontre : • Dans un cristal ionique • Paires d’ions dans un solvant (séparées ou non par le solvant)

  15. Les forcesintermoléculairesen jeu Énergie de «liaison» Forces de dispersion de London Debye Keesom Pont Hydrogène Attraction entre ions de signes contraires

  16. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  17. Quelques solvants usuels en CL d+ d-

  18. T° éb. Paramètre de polarité e0 Miscibilité à l’eau Tétrahydrofurane (THF) 66° 0.53 oui acétone 56° 0.53 oui acétonitrile 81° 0.52 oui isopropanol 82° 0.60 oui éthanol 78° 0.7 oui méthanol 64.5° 0.7 oui eau 100° élevé oui ! Quelques solvants usuels en CL

  19. Quelques solvants usuels en CL Accepteurs et donneurs de pont H Accepteurs de pont H

  20. Quelques solvants usuels en CL L'eau ! ! ! Forces de cohésion importantes : tension superficielle élevée eau : 73 mN/m méthanol : 23 mN/m viscosité élevée eau : 0,89 cP méthanol : 0,54 cP température d'ébullition exceptionnelle H2O (MM 18) : 100°C NH3 (MM 17) : - 33°C méthanol : 65°C constante diélectrique très élevée eau : 78 méthanol : 33

  21. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  22. Quelques phases stationnaires en GC Polarité croissante

  23. Les forces intermoléculaires en GC PM = N2, He, H2 Elution rapide de molécules "volatiles" non pas à l'état pur, mais dans l'état adsorbé sur la PS utilisée. CH3OH sur diméthylsilicone (PS apolaire) se comporte comme une molécule "volatile". Son élution sur PS polyéthylèneglycol sera nettement plus lente. En revanche, à l'état pur les molécules de CH3OH s'associent par ponts H : le composé possède un point d'ébullition relativement élevé.

  24. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  25. Les phases stationnaires polaires en LC La silice : SiO2 Solide macromoléculaire Caractéristiques du solide : Forme des grains : sphérique ou irrégulière Granulométrie: 1,7 à 10 µm de diamètre moyen (ou plus pour la chromatographie préparative) Porosité : taille moyenne des pores ( 60 - 1000 Å); plus de 95% de la surface du solide se trouve dans le volume poreux. Pureté Groupes silanols en surface Donneurs et accepteurs de pont H Partiellement ionisés à partir d'un pH 3

  26. Les phases stationnaires polaires en LC Échange sur la PS Interaction forte Interaction forte "Logique" d'élution : mode "normal" Pour un éluant donné, les mi seront élués par ordre de polarité croissante. Éluant puissant = éluant polaire, ayant une forte affinité pour la PS, tous les mi sont élués rapidement (non sélectif) Éluant sélectif = éluant apolaire (alcanes) Gradient = polarité croissante

  27. Les phases stationnaires polaires Pentane 0,00 Hexane 0,01 Toluène 0,22 Dichlorométhane 0,30 Acétate d'éthyle 0,48 MTBE 0,48 Acétonitrile 0,52 Tetrahydrofurane 0,53 Méthanol 0,70 Échelle de polaritée° En pratique sur silice, un solvant polaire =dichlorométhane pur, acétate d'éthyle pur, un solvant contenant un faible %age d'alcool.

  28. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  29. Les phases stationnaires apolaires en LC Modification chimique de la surface de la silice : Phase inverse C18 Reversed Phase RP-C18

  30. Autres phases stationnaires greffées Modification chimique de la surface de la silice : Autres "chimies" résultant de transformation des silanols de surface : R = -C8H17 (RP C8) -CH2CH2CH2-Phényl -CH2CH2CH2CN -CH2CH2OCH2CH(OH)CH2OH -CH2CH2CH2NH2 etc ... Phases polaires

  31. Les phases stationnaires apolaires "Logique" d'élution : mode "inverse" Qui se ressemble, s'assemble ???

  32. Les phases stationnaires apolaires Interaction forte Interaction forte "Logique" d'élution : mode "inverse" Pour un éluant donné, les mi seront élués par ordre de polarité décroissante. Éluant puissant = éluant non aqueux, solubilisant bien les composés mi. Ils sont tous élués rapidement (non sélectif). Éluant sélectif = éluant fortement aqueux, forte cohésion, où les composés mi sont faiblement solubles. Gradient = polarité décroissante, teneur en eau décroissante.

  33. PS PM Gradient d’élution Ordre d’élution Phase normale (NP) très polaire peu polaire Polarité croissante Exemple : hexane + proportion croissante d’acétate d’éthyle Les moins polaires sont plus rapides Phase inverse (RP) apolaire très polaire Polarité décroissante Exemple : H2O + proportion croissante de CH3OH Les plus polaires sont plus rapides Les phases stationnaires polaires et apolaires : comparaison.

  34. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  35. L'échange d'ions • Séparation et dosage d'ions. Exemples : • les nitrates dans l'eau • une protéine dans un liquide physiologique Échange d'anions résine faible : DEAE (diéthylaminoéthyl), amino résine forte : ammonium quaternaire Échange de cations résine faible : -CH2COO-(CM, carboxyméthyl) résine forte : -SO3- (sulfonique) ex : SP = sulfopropyl

  36. L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! Ka = 10-4, par exemple  pKa = 4 pH = pKa = 4 50% de HA, 50 % de A- pH = pKa - 1 = 3 90% de HA, 10% de A- pH = pKa - 2 = 2 99% de HA, 1% de A- pH = pKa + 1 = 5 10% de HA, 90% de A- pH = pKa + 2 = 6 1% de HA, 99% de A-

  37. L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! Ka = 10-9, par exemple  pKa = 9 (càd : Kb = 10-5) pH = pKa = 9 50% de BH+, 50 % de B pH = pKa - 1 = 8 90% de BH+, 10 % de B pH = pKa - 2 = 7 99% de BH+, 1% de B pH = pKa + 1 = 10 10% de BH+,90% de B pH = pKa + 2 = 11 1% de BH+,99% de B

  38. L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! résine résine résine

  39. L'échange d'ions Intervention omniprésente du pH ! CM, carboxyméthyl : résine résine SP, sulfopropyl : résine résine

  40. L'échange d'ions R = résine • K dépend surtout de la nature des ions échangés : affinité relative de Cl- et OH- / Na+ et H+ dans les exemples ci-dessus • Deux facteurs : • la charge de l’ion (ex : Mg++ plus retenu que Na+) • pour une même charge, en phase aqueuse, c’est la taille de l’ion hydraté qui importe. F- et OH- (pour les anions), H+ et Li+ (pour les cations) ont des rayons hydratés très grands et sont peu retenus par la PS.

  41. L'échange d'ions Sur résine forte R = résine adsorption élution Les concentrations agissent sur la position de l’équilibre. Une concentration élevée en ions, même de faible affinité, pourra éluer un ion fortement retenu. Gradient d’élution : concentration croissante en ions.

  42. L'échange d'ions Sur résine faible R = résine adsorption élution Un tampon maintient le pH constant tout au long de la chromatographie. Il maintient une charge identique sur la résine. L'ion du tampon utilisé, ayant le signe contraire à la charge de la résine, est présent au moment du dépôt de l'échantillon (conditionnement). Gradient d’élution : concentration croissante en ions provenant d'un sel ne modifiant pas le pH (NaCl, par ex.)

  43. L'échange d'ions Appariement d’ions sur phase inverse La PS C18 est conditionnée avec un éluant contenant un surfactant anionique. Il se fixe sur la PS et elle se comporte en échangeuse de cation. Permet l’échange d’ions en phase organique. Echange d'anion avec un détergent cationique :

  44. Plan Général • Les forces intermoléculaires • Solvants usuels en LC • Phases stationnaires usuelles en GC • Les phases stationnaires polaires en LC • Les phases stationnaires inverses en LC • L'échange d'ions • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.

  45. Perméation de Gel - Exclusion stérique • Séparation d'après la taille des molécules. Exemple de domaine d'application : • biopolymères tels que les protéines • polymères de synthèse La phase stationnaire est poreuse : le liquide qui s'y trouve occupe un volume Vp, qu'on appelle le volume poreux. La taille moyenne des pores est telle que certaines molécules n'ont pas accès à tout le volume poreux. molécules Un grain de PS

  46. Perméation de Gel - Exclusion stérique Volume interstitiel, en dehors des pores = volume mort V0 • Volume total du lit chromatographique : Vt • Il est constitué de  90% de liquide : • Volume interstitiel, en dehors des pores = volume mort V0 ( 30%) • Volume poreux = Vp ( 60%) Un grain Vt  Vp + V0

  47. Perméation de Gel - Exclusion stérique La concentration d’une molécule dans le volume poreux dépend des tailles respectives du pore et de la macromlolécule. Elle ne dépend pas d’interactions avec la PS ou la PM.

  48. Perméation de Gel - Exclusion stérique Exclusion totale K = 0 Perméation totale K = 1

  49. Perméation de Gel - Exclusion stérique Pour une molécule de taille donnée : VRi = V0 + Ki . Vp Fraction du volume poreux, accessible à la macromolécule i 0  K  1 Volume de rétention = volume de liquide sorti de la colonne jusqu'à l’élution de la macromolécule i volume interstitiel accessible à toute molécule quelque soit sa taille

  50. Perméation de Gel - Exclusion stérique Pour une molécule de taille donnée : VRi = V0 + K . Vp Si on néglige le volume de solide dans le lit chromatographique : Vp = Vt - V0

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