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GALACTOSEMIA

Química Biológica Patológica. GALACTOSEMIA. Tema:9 (Bolilla 9).  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar. TEMA 9:.

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  1. Química Biológica Patológica GALACTOSEMIA Tema:9 (Bolilla 9)  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar

  2. TEMA 9: • Galactosemia. Manifestaciones clínicas. Metabolismo de la galactosa en la galactosemia. Defectos enzimáticos. Metabolito tóxico. Diagnóstico. Prevención. Detección de portadores. • Fructosuria. Metabolismo de la fructosa. Fructosuria esencial. Intolerancia hereditaria a la fructosa. Cuadro clínico. Mecanismo bioquímico. Diagnóstico.

  3. Origen de Galactosa • Leche •  Ligada con enlaces tipo  en ciertas legumbres, verduras y frutas. •  En forma de galactocerebrósidos y gangliósidos en algunas vísceras de animales

  4. Absorción de Gal Familia SGLT Sodium-dependent glucose cotransporters, symporter = SLC5A1 • SGLT1 • GLUT 5 • GLUT 2

  5. 80% Vía Glicolitica 20% Gpr y Glp Glucosa-6-Fosfatasa Glucosa-6- Deshidrogenasa GLUCEMIA SANGRE Via de las Pentosas D-Ribosa-5-P +NADPH + CO2 • Via Glicolitica • Piruvato  •  Acetil CoA Ciclo Krebs  CO2+ H2O

  6. (1906–1987), Premio Nóbel, 1970

  7. “por su descubrimiento de los nucleótidos de azúcar y su rol en la biosíntesis de carbohidratos” Papel de los UDP-azucares: en los mamíferos, la mayoría de los grupos glucosilos son donados por UDP-azúcares

  8. Metabolismo Normal Galactosa: Vía Leloir

  9. Desarrollo de cataratas Vía Glicolítica galactitol + UTP Glu-1-P Aldosa Reductasa (AR) ADP ATP UGP (Pirofosforilasa) GALK GALT (4) Dieta -D-galactosa Gal-1-P UDP-Gal (1) GALE UDP-Glu (3) PPi (2) UGP (Pirofosforilasa) Galactosa Deshidrogenasa (GDH) UTP galactonato Vía de las Pentosas IMPasa Acido D-Galactónico Acido -ceto-D-Galactónico  D-Xilulosa  D-Xilulosa Fosfato Via de las Pentosas Fosfato CO2

  10. VIAS ALTERNATIVAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA • Reducción a galactitol • Oxidación a galactonato • La “vía de la pirofosforilasa” y bypass a GALT

  11. (2) UTP + UGP (UTP-glucosa/galactosa Pirofosforilasa) (3) (1) IMPasa Vía Glicolítica Producción Endógena de Galactosa Glu-1-P ADP ATP GALK GALT Dieta -D-galactosa Gal-1-P UDP-Gal GALE UDP-Glu

  12. DESORDENES HEREDITARIOS DEL METABOLISMO GALACTOSA • Galactoquinasa (GALK) • Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) • Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE)

  13. Galactoquinasa (GALK) • El gen GALK1 se encuentra en el brazo  largo (q)  del cromosoma 17 en la posición 24 • La enzima se expresa en hígado, GR, leucocitos, fibroblastos, placenta y varios tejidos fetales y adultos en humanos El dominio N terminal de la enzima monomerica se muestra en azul y el dominio C-terminal en rojo. Se muestra el sitio activo donde se une galactosa y fosfato inorgánico

  14. Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) • El gen que codifica GALT esta localizado en el cromosoma 9p13 y tiene una extensión de 4,3Kb, constituido por 11 exones. • Las dos subunidades del dímero de la enzima se muestran en color rojo y azul. Se indica la posición de los metales en formas de esferas. En el sitio activo de la enzima se encuentra unido UDPglucosa. • Tiene regulación dietaria y hormonal Se expresa en hígado, ID, ovarios, cerebro, fibroblastos y eritrocitos

  15. Gen GALT 3’ 5’ Exón: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tamaño 82 170 76 49 130 57 123 133 83 155 78 (nt) 4,3 Kb Proteína: 379 aminoácidos

  16. Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE) • El gen GALE mapea en el cromosoma 1p36.  El gen incluye 12 exones que se extienden alrededor de 4 kb de ADN genómico • Cada subunidad de la enzima dimerica se plega en dos dominios. Los dominios N y C terminal están en color azul y rojo, respectivamente. Unido al sitio activo NADH y UDP-glucosa. Se expresa en hígado, ID, fibroblastos y eritrocitos

  17. Biología Molecular GalactoquinasaAl menos 25 mutaciones diferentes han sido identificados en los lugares de GALK galactoquinasa en pacientes.  • Frecuencia: 1/214.470 • La enzima humana incluye 392 aminoácidos con una masa molecular de 42 kDa • Algunas de las mutaciones son: 1569CT en el exón 2 (R68C), 7093CT en el exón 6 (T 288M), 7538GC en el exón 8 (A384P) y una deleción  de un par de bases en el exón  5 (2833del C).

  18. Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa • Las 6 mutaciones más comunes p.Q188R, p.S135L, p.K285N, p.L195P, p.T138M y p.Y209C son el 80% de los casos de galactosemia clásica. Una 7ª mutación IVS 2-2 AG ha sido descrita en la población hispana. • Mutación N314D: Variantes

  19. Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa (GALT)Frecuencia: • Galactosemia Clásica: 1:42.894 • Deficiencias Parciales: 1:14.623

  20. VARIANTES ALELICAS DE GALT

  21. La variante Duarte es un alelo polimorfico del gen GALT que resulta en actividad alterada de la enzima. Este polimorfismo común en la población es sin signos clínicos o síntomas

  22. Duarte-1 (Los Angeles) Esta asociado con aumento de la actividad de GALT (110-130% de lo normal) N314D esta en un desequilibrio de ligamiento con la sustitución silenciosa L218L (c.652CT). La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7 Duarte-2 (D2) Esta asociado con disminución de la actividad de GALT El polimorfismo N314D es un ligamiento en desequilibrio con 3 sustituciones intrónicas (IVS 4nt-27gc; IVS 5nt-24ga y IVS 5nt+62ga) y una deleción de 4pb en el promotor de GALT La frecuencia de los alelos D2 es de 5,1 Deficiencia de GALT: Alelos Duarte: La mutación N314D esta asociada con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de GALT alterada pero con fenotipos subclínicos diferentes.

  23. El Alelo Duarte puede tener significancia clínica con otras mutaciones en el gen GALT, llamadas galactosemia DG (genotipo Duarte/Galactosemia). • La combinación de una mutación clásica (G) y la variante D muestra una disminución de la actividad de GALT pero no resulta típicamente en los síntomas de galactosemia clásica

  24. Diagnostico Bioquímico Determinación de metabolitos Determinación de actividad enzimática

  25. Determinación de metabolitos y actividad enzimática: • Gal-1-P en eritrocitos • Gal TOTAL en eritrocitos • Actividad Enzimática: GALT

  26. Diagnóstico Neonatal Sistemático del Recién Nacido • UMTEST GAL de SUMA:usado en CSSL

  27. Pesquisa Neonatal: medición de Galactosa TOTAL

  28. Pesquisa Neonatal

  29. Gal-1-fosfato (mg/dl) • Gal-1-P= Gal Total (2º) – Gal libre (1º) • %Gal-1-P= [Gal-1-P] / [Gal Total]

  30. Determinación Enzimática • Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) en eritrocitos

  31. Basados en la Reacción de Beutler

  32. Ausencia NADPH – No hay decoloración del Azul de Metileno  NADPH   actividad de GALT   rapidez de decoloración de AM

  33. SIGMA

  34. Análisis Molecular: • Detección de Mutaciones por amplificación por PCR+ER

  35. Mutación Q188R Mutación N314D Mutación S135L En Brasil la galactosemia tiene una frecuencia de 1:19.984 recién nacidos. • Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp. El cambio de de una A por G crea un sitio de corte para la enzima de restricción HpaI. El alelo Q188R genera dos bandas de 158 y 98 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 256pb. • N314D, Duarte variant:exon 10, Por PCR se amplifica PA: 166pb La mutación genera un sitio de corte para la enzima Ava II El alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 166pb. • S135L: exon 5, Por PCR se amplifica PA: 252 bp. La mutación genera un sitio de corte para la enzima TaqI en el exón 5. El alelo S135L genera dos bandas de 192 y 60 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 252pb.

  36. (A) Q188R – exon 6 GALT gene. L, marker; lane 1, mutated homozygous (referred case); lanes 2 and 3, heterozygous (two screened cases) and lanes 4–10, homozygous wild-type allele. Q188R (+) Hpa (B) N314D – exon 10 GALT gene. L, marker; lane 4, homozygous mutated allele (referred case); lanes 1, 2, 5 and 6, heterozygous and lines 3, 7–10, homozygous wild-type allele N314D (+) AvaII After amplification, the PCR products were digested overnight at 37-C using the enzymes HpaII for exon 6, AvaII for exon 10 and TaqI for exon 5.

  37. Patogenia I: deficiencia de GALK • La deficiencia de GALK impide la fosforilación de galactosa a Gal-1-P, lo que supone un acúmulo de galactosa en sangre, y la consiguiente producción de galactonato y galactitol • El acúmulo de galactitol produce edema de las fibras del cristalino, y una desnaturalización de las proteínas, responsable del desarrollo de la catarata.

  38. Aumento de Galactitol • Catarata nuclear “en gota de aceite” que puede tener un inicio intrauterino, en casos excepcionales

  39. Patogenia II: déficit GALT • El déficit GALT se produce un aumento de Gal-1-P eritrocitaria y de la galactosa plasmática con la consiguiente galactosuria • La galactosa en exceso en el plasma es convertida en galactonato, y en galactitol.

  40. Patogenia II: Metabolitos tóxicos • Gal-1-P: - Pi y ATP   AMP deaminasa  Ac. Urico; inhibición de enzimas. - Inhibe glu-6-fosfatasa y glucógeno fosforilasa hipoglucemia - Inhibe la función inositol monofosfatasa inositol • Balance UDP-Gal / UDP-Glu:  ac. cerebrosido-galactosil-transferasa

  41. PiADPAMP HGPRT: hipoxantina –guanina- fosforribosiltransferasa

  42. Patogenia III: déficit GALE • En el déficit GALE se produce un acúmulo de UDPGal e incluso de Gal-1-P • Hay un déficit en la síntesis endógena de galactosa y en la producción de galactolípidos y galactoproteínas

  43. Determinación de metabolitos y actividad enzimática: • Gal-1-P en eritrocitos • Gal TOTAL en eritrocitos • Actividad Enzimática: GALT

  44. ?? Duarte 2 homocigota, DG??

  45. Diciembre 2010 con un total de 643.409 RN • 15 pacientes con Galactosemias Clásicas (Frecuencia 1:42.894), • 44 pacientes con Deficiencias Parciales de GAL-T (Frecuencia 1:14.623), • 3 pacientes con Deficiencias de GAL-K (Frecuencia 1:214.470) y • 2 pacientes con Deficiencias de GAL-E (Frecuencia 1:321.705). 1: 10.053 Otros países: 1: 68.400

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