Dosagem Microbiológica de Antibióticos e Fatores de Crescimento.

1. Dosagem Microbiológica de Antibióticos e Fatores de Crescimento. • QUESTÕES DE PROVAS; • CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS; • HORÁRIO DE ATENDIMENTO ON-LINE; Blog do professor: http://chicoteixeira.wordpress.com Página EAD: http://www.aedmoodle.ufpa.br/moodle

2. Introdução A necessidade de confirmação da eficácia terapêutica dos produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de preocupação; 9000-8000 a.c. A quantificação da substância ativa demanda sempre no emprego de uma avaliação comparativa, frente a um padrão biológico de referência; Há que se considerar também, o aspecto econômico, assim como o de falsificações com moléculas estruturalmente similares; Há situações em que a margem entre a dose ineficaz do ponto de vista terapêutico e uma dose tóxica é relativamente pequena; Pode ser empregado um ensaio macrobiológico ou direto, como o ensaio de insulina empregando camundongos, ou ainda microbiológico ou indireto, como o ensaio de estreptomicina e tetraciclina;

3. Introdução No segundo caso os dois métodos mais usados são de difusão em ágar (ou em placas) e o turbidimétrico (ou de tubos), prestando-se particularmente à determinação do teor de antibióticos e fatores de crescimento; 9000-8000 a.c. O método de difusão em ágar relaciona o tamanho da zona de exibição (fatores de crescimento) ou inibição (antibiótico) com a dose da substância ensaiada e é mais comumente empregado para determinação de antibióticos;

4. Ensaio de Difusão em Ágar O ensaio por difusão, desenvolvido para antibióticos, é um método físico, no qual um microrganismo é usado como revelador; Muitas das variações observadas são causadas pela negligência dos aspectos físico-químicos, e não por variações biológicas; 9000-8000 a.c. O método de difusão emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em sistema de mono ou bicamada, através do qual a substância-teste se difunde;

5. Ensaio de Difusão em Ágar A solução-teste é aplicada sobre a superfície deste meio, em uma área restrita, e as placas são então encubadas; O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porém, áreas onde tenha ocorrido a difusão do antibiótico, gerando contraste e resultando a chamada zona de inibição do crescimento; 9000-8000 a.c. Formação de zonas de inibição (x) do crescimento microbiano, decorrente da difusão de antibiótico, em ágar contido na placa (difusão radial) e tubos (difusão linear);

6. Ensaio de Difusão em Ágar Formação da Zona de Inibição de Crescimento A aplicação de conhecimentos de difusão para avaliação de potência de antibióticos exige padronização de condições, pois há que conciliar os fenômenos físicos (difusão) e biológicos (microrganismo sensível, meio de cultura, incubação), a fim de que a distância de difusão seja medida experimentalmente, após a revelação sob a forma de zona ou halo de inibição de crescimento; Isto significa que o microrganismo teve seu crescimento inibido em função da concentração de antimicrobiano difundido ser capaz de impedir o seu desenvolvimento, em oposição ao restante do meio de cultura; A necessidade do dimensionamento das zonas de inibição de crescimento conduz à exigência de inóculo com população microbiana homogênea. Assim, foi possível a determinação teórica dos valores de diâmetro para diferentes concentrações do antibiótico;

7. Importância da padronização A principal melhora na orientação laboratorial dos antibiogramas nas últimas décadas provém do desenvolvimento de procedimentos padrões; É importante aderir aos protocolos para obter resultados passíveis de reprodução; Fatores importantes do Antibiograma: • Meio de crescimento: O caldo de cultura e o ágar Mueller-Hinton foram escolhidos para as bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas;

8. Fatores importantes do antibiograma • pH: Deve estar entre 7,2 e 7,4 a temperatura ambiente. O pH do meio em caldo de cultura pode ser testado diretamente com um eletrodo de pH, e o meio do ágar pode ser testado pela maceração de ágar suficiente, de modo que a ponta do eletrodo possa ser imersa; • Soro: O grau de ligação dos antibióticos às proteínas apresenta grande variação. Podem ser obtidos valores diferentes se for adicionado soro ao meio;

9. Fatores importantes do antibiograma • Concentração [ ] de cátions: A concentração de cátions divalentes Ca2+ e Mg2+ afeta os resultados da sensibilidade quando são testadas determinadas combinações de espécies bacterianas e antibióticos; Pseudomonas aeruginosa Reação cruzada

10. Fatores importantes do antibiograma • Concentração [ ] de cátions: O caldo de cultura Mueller-Hinton apresenta [ ]s muito baixas de cátions divalentes e deve ser suplementado para concentrações fisiológicas; Quando os microrganismos estão crescendo em meio deficiente em cátions, a permeabilidade da parede celular aos antibióticos aminoglicosídeos e a outros compostos aumenta; Alguns lotes do ágar Mueller-Hinton podem na verdade apresentar concentração anormalmente alta desses cátions, de modo que são produzidas pequenas zonas inibidoras quando P. aeruginosa é testado com aminoglicosídeos; Assim, os microrganismos são mais sensíveis à ação dos aminoglicosídios, produzindo [ ] inibitória mínima falsamente baixa ou grandes zonas inibidoras;

11. Fatores importantes do antibiograma • Atmosfera: O ágar ou caldo de cultura é incubado em uma incubadora em ar ambiente. Uma incubadora com CO2 não deve ser utilizada para testes de rotina. O ácido carbônico formado na superfície do ágar ou no caldo pode causar redução do pH; Nos laboratórios com pequena carga de trabalho e onde existe apenas incubadora de CO2, é aceitável colocar as placas ou tubos de sensibilidade em uma jarra selada;

12. Fatores importantes do antibiograma • Temperatura: As placas e os tubos devem ser incubados rotineiramente a 35ºC. Quando em temperaturas mais altas, a detecção de estafilococos resistentes a oxacilina fica comprometida. Se houver suspeita de resistência contra oxacilina e não houver manifestações em 35ºC, as placas ou tubos podem ser incubados a 30ºC;

13. Fatores importantes do antibiograma • Inóculo: É, em geral, preparado a partir do caldo de cultura que foi incubado por 4 a 6 horas, quando o crescimento é considerado em fase logarítmica; Devem ser coletadas amostras de várias colônias de aspecto semelhante para diminuir a variação na população bacteriana; A densidade da suspensão é ajustada para aproximadamente 108 CFU/ml;

14. Escala de McFarland É preparado adicionando-se 0,5 ml de 0,048M BaCl2 (1,175% p/v BaCl2•H2O) a 99,5 ml de 0,36N H2SO4. Alíquotas de 4 a 6 ml do padrão de turbidez do BaSO4 são distribuídas em tubos de mesmo tamanho, fechado com tampa de rosca, firmemente selados e armazenados, no escuro, a temperatura ambiente; Comumente o grau de turbidez no caldo de cultura é comparado com o padrão, visualizando os dois contra um fundo branco no qual foram desenhadas linhas pretas;

15. Fatores importantes do antibiograma • Agentes Antimicrobianos: Discos impregnados com antimicrobianos devem ser armazenados a -20ºC ou menos em condição anidrosa. Os fabricantes de discos precisam controlar rigorosamente a concentração dos agentes antimicrobianos nos discos para 60-120% do teor declarado; a variação existente é em geral consideravelmente menor;

16. Fatores importantes do antibiograma • Agentes Antimicrobianos: Um pequeno estoque pode ser mantido em temperaturas de refrigerador em um dessecador; Os discos sempre devem ser aquecidos até à temperatura ambiente antes de se abrir o dessecador, de modo que a condensação da umidade do ar não reidrate parcialmente os discos.;

17. Teste de sensibilidade em Macrodiluição em Caldo de Cultura Esteve entre os primeiros testes a serem desenvolvidos e ainda serve como método de referência;

18. Teste de sensibilidade por Diluição em Ágar É o segundo método de referência, foi adaptado com sucesso para uso rotineiro nos grandes laboratórios avaliando apenas as [ ]s escolhidas dos antimicrobianos;

19. Teste de sensibilidade por Difusão em Disco Assim que o disco impregnado com agente antimicrobiano entra em contato com a superfície úmida do ágar, a água é absorvida pelo filtro de papel e o agente antimicrobiano se difunde para o meio circulante;

20. Interpretação dos Resultados

21. OBRIGADO