Mikrobiel dechlorering af TCE - molekylære teknikker til bestemmelse af tilstedeværelse og aktivitet af specifikke nedbr

1. Mikrobiel dechlorering af TCE - molekylære teknikker til bestemmelse af tilstedeværelseog aktivitet af specifikke nedbrydere Carsten Suhr Jacobsen, GEUS Jacob Bælum, GEUS Charlotte Scheutz, DTU Miljø Mette Broholm, DTU Miljø

2. Om at gå sukkerkold  • Mikrobielle populationer i naturlige jord og grundvands miljøer er som regel sultne.. • Sultne bakterier i disse miljøer kan antage forskellige former eller aktivitetsniveauer… • Levende og aktive bakterier i jord og grundvandssedimenter kan detekteres både med teknikker til at måle dyrkbare bakterier som med DNA baserede teknikker – inaktive bakterier kan ofte kun findes med DNA.. • Ved anaerob deklorering eller halorespiration tilsætter vi store mængder af en kulstof kilde og tvinger på den måde redox forholdende ned..

3. Om at trække vejret på klor • Mikrobiel deklorering af TCE/PCE/cisDCE/VC drives af bakterier, der trækker vejret på klor. • Klor i form af PCE/TCE er ikke den værste elektronacceptor. • Men der sker først den ønskede deklorering når redox forholdende er tilstrækkeligt lave. • Mange bakterier kan trække vejret på forskellige måder – f.eks. Pseudomonas fluorescens er også i stand til at denitrificere

4. Tælling af Dehalococcoides sp. i grundvandssedimenter • DNA baseret kvantificering af antallet af bakterier i en miljøprøve foretages på baggrund af 16S rRNA generne • Primere til PCR er fundet så de er specifikke for Dehalloccoides sp. eller Dehalobacter sp. • Man kan på den samme prøve som der bestemmes specifikke bakterier vælge at analyserer for total antal bakterier ved at bruge generelle primere

5. cDCE Jensen’s Autoværksted + Sukker 500 ml vand (eller mindre) filtreres gennem 0,22 µm filtre og DNA ekstraheres. Real-time PCR kvantificering af Dehalococcoides sp. bakterier. Real-time PCR kvantificering af total antal bakterier Renhedskontrol af DNA Real-time PCR kvantificering af gener kodende for vinyl klorid reductase enzymer. Vand prøver DNA ekstraktion + intern kontroll (gfp gen) Real-time PCR med gfp specifikke primers 10 mL DNA ekstrakt

6. Tælling af antal specifikke nedbryder gener (vcrA) • Ikke alle Dehalococcoides sp. har det sidste trin i nedbrydningsvejen men stopper ved cis-DCE - eller værre VC. • Det er heller ikke sikkert, at alle der kan nedbryde cisDCE eller VC er i familie med Dehalococcoides sp. • To kendte gener findes typisk i de prøver vi har kigget på: vcrA eller bvcA

7. Treatabillity forsøg med fokus på KB1 Tre forskellige koncentrationer af TCE Tre forskellige koncentrationer af KB-1 Total 27 serumflasker 100 g sediment fra Rugårdsvej 200 ml sterilt hanevand Tilsætning af laktat ~6 mM The analyses • Klorerede ethener • Fede syre • Anioner • Methan • DNA og RNA ekstraction

8. Treatabillity forsøg – kan vi spare på KB1? • Ingen KB1 tilsætning i Rugårdvej sediment gav dannelse af VC • 105 KB1 celler giver ok resultat ved 1000 µg TCE men forsinket dannelse af VC og ethen ved 10.000 µg. 107 celler altid hurtigst (og viser ingen samlet vækst) • Ved 105 KB1 celler ses overraskende vækst af Dhc og vcrA uden TCE – måske kan visse Dehalococcoides sp. trække vejret på andet end klor….

9. vcrA og bvcA gener viser ikke samme mønster • bvcA gener opformeres fra de naturlige populationer i sedimentet fra Rugårdsvej • bvcA gener opformeres ikke når den kommercielle kultur KB1 har ”magten”

10. Hvad viser vores DNA baserede kvantificeringer • Sammenhæng mellem antal Dehalococcoides sp og vcrA gener og hvor hurtigt nedbrydningen går fra TCE til ethen under de redoxforhold vi fik etableret. • bvcA gener vokser kun i naturlige prøver men ikke i prøver tilsat KB1, samtidig med naturlig vækst af bvcA gener - vokser også vcrA. • Når KB1 podes til ca. 107 celler per ml sker der ikke yderligere vækst. • Når KB1 podes med 1% (105 celler) sker der vækst på den tilsatte laktat – også selv om der ikke er målbare mængder af TCE og cisDCE • Hvis man kan leve med en senere nedbrydning af cisDCE kan man pode med mindre KB1 • Samlet set højere signal fra vcrA og bvcA end fra Dehalococcoides sp 16S gener.

11. Kan de DNA baserede metoder direkte overføres til feltskala ? • Ja - hvis prøven er repræsentativ…. • Men ofte strømmer vandet – nyt stof frigives osv. så det er vanskeligt at vurdere om de tælletal man får er udtryk for aktivitet. • I stedet kan man kvantificerer mRNA direkte i vandprøven.

12. cDCE • 500 ml vand (eller mindre) filtreres gennem 0,22 µm filtre; nedfryses på flydende kvælstof; RNA og DNA ekstraheres. • Revers transcriptase enzym omdanner mRNA til cDNA • Real-time PCR kvantificering af gener (DNA) samt transcripter (mRNA) kodende for vinyl klorid reductase enzymer. Jensen’s Autoværksted + Sukker Vand prøver DNA ekstraktion - 80°C RNA ekstraktion Revers transcriptase Real-time PCR

13. Kvantificering af mRNA • Prøver fra samme forsøg (10.000 µg TCE/ml og 107 celler KB1/ml) er oprindeligt frosset ned på flydende kvælstof. • Kvantificering af DNA prøver viser at antallet af gener stiger. • Kvantificering af mRNA/DNA er dog et meget stærkt mål for aktivitet. • Aktiviteten peak’er samtidig med vinylklorid dannes og forsvinder. • Tilsyneladende er aktiviteten af vcrA høj sammenlignet med Jacobs tfdA gen hvilket giver håb for detektionsniveauet. • 

14. Opsummering • Det er muligt at kvantificere dels tilstedeværelsen af bakterier som Dehalococcoides sp. og Dehalobacter sp. – såvel som total bakterier ud fra samme DNA prøve. • Det er fornuftigt at analyserer også for bvcA gener (ud over vcrA) hvis man ønsker at fastslå potentialet for dekorering. • Analyse for mRNA/DNA for nedbryder gener som vcrA og bvcA burde kunne blive standard.

15. Tak til: • Christine Mosegaard Jensen • Rikke Brockmann • Pia Bach Jakobsen • Jens Schaarup Sørensen • Det Strategiske Forskningsråd gennem REMTEC centeret for ekstern finansiering

16. Tilgængelighed • GEUS har valgt at tilbyde vore molekylærbiologiske analyser på ITV vilkår. • Dette gælder både de nu nævnte analyser for nedbrydning af chlorerede opløsningsmidler – såvel som olieprodukter og pesticider. • mRNA analyser er endnu ikke prisfastsat, men ekstraktion, renhedskontrol og kvantificering af vcrA og Dehalococcoides 16S gener i DNA prøver fra 500 ml vand har kostet 1200 kr. i et stykke tid. • Vi stiller gerne protokoller til rådighed…