Funkcije proteinov

1. Funkcije proteinov • Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) • Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) • Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) • Kontraktilni proteini • Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko bioloških membran • Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) • Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) • Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

2. Biološke membrane in transport • Membrane ločujejo celico od okolja in znotraj celice v različne celične predele • Osnovni gradniki membran – bipolarni lipidi • Komunikacije med celicami omogočajo membranski proteini: - skozi celično membrano prenašajo organske molekule in ione - receptorji na celični površini zaznajo ekstracelularne signale in sprožijo specifične poti v celici - adhezijske molekule skrbijo za stik med celicami • Znotraj celic membrane vzdržujejo prostorsko ločitev različnih procesov (sinteza lipidov in proteinov, prenos energije v mitohondrijih...) • Strukturne lastnosti membranskih proteinov pogojujejo njihovo funkcijo • Prenos (transport) topljenca skozi biološko membrano - pasivni transport - aktivni transport - nekaj primerov

3. Model tekočega mozaika strukture membrane Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

4. Sestavine plazemske membrane nekaterih organizmov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

5. Periferni in integralni proteini – izolacija iz membran Periferne membranske proteine izoliramo z blagimi postopki: sprememba pH ali ionske moči medija, dodatek uree ... Integralne membranske proteine ekstrahiramo z detergenti – porušijo se hidrofobne interakcije med lipidi, nastanejo miceliji okrog proteinske molekule. Membranski protein, kovalentno vezan na lipide, sprostimo z delovanjem encima fosfolipaze C Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

6. Intergralni transmembranski protein – glikoforin v membrani eritrocitov Sladkorji so vezani na ostanke Thr in Ser z O-glikozidno vezjo in na Asn z N-glikozidno vezjo. Sladkorna komponenta služi medceličnemu prepoznavanju 30 Á 30 Ser Thr V -vijačnici zavzema 1 ak 1,5 Á→ 20 ak leži v transmembranskem delu polipeptidne verige Asn

7. Vrste integralnih membranskih proteinov transmemebranski del (~20 ak) polipeptidne verige vpet s hidrofobnimi interackcijami z lipidi v membrano zunanji deli popipeptidne verige sestavljajo predvsem ak s hidrofilnimi -R Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 znotraj zunaj Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

8. Primer transmembranskega proteina: bakteriorodopsin bakterije Halobacterium salinarum Amino konec zunaj znotraj Funkcija: črpanje protonov na račun energije svetlobe

9. Porini - transmembranski proteini, ki prepuščajo nabite delce skozi membrane Supersekundarna struktura “sodčka” transmembranskih proteinov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

10. Periferni membranski proteini – kovalentna vez med proteini in membranskimi lipidi tioestrsa vez Cys amidna/peptidna vez Gly znotraj zunaj Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

11. Periferni membranski proteini – kovalentna vez med proteini in membranskimi lipidi(nadaljevanje) etanolamin GPI - glikozil-fosfatidil inozitol C-konec polipeptidne verige znotraj zunaj

12. Lipidi in proteini difundirajo lateralno v membranskem dvosloju – primer omejenega gibanja anionskega izmenjevalca in glikoforina v membrani eritrocita Integralni membranski proteini so pričvrščeni na proteina citoskeleta, spektrin in ankirin, kar omejuje njihovo lateralno gibanje Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

13. Integralni membranski proteini – povezava med celicami 18  podenot 8  podenot zunaj N-CAM = neuronal cell adhesion molecule znotraj Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

14. Integrin – receptor signala Integrini uravnavajo različne procese: zbiranje levkocitov na mestu poškodbe, celjenje tkiva, aktivnost imunskega sistema, invazivnost tumorja Mutacija gena za adhedrin – dedna bolezen (CD18) – levkociti ne pridejo do inficiranih celic, otrok umre zaradi infekcije Povezava celice preko membranskega proteina integrina z ekstracelularnim matriksom Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

15. Mikrodomene (rafti) v plazemski membrani li Model strukture lipidnega rafta Posnetek lipidnega rafta z metodo “atomic force microcsopy” Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

16. Protein kaveolin prisili membrano, da se uvije navznoter - endocitoza Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

17. Biološke membrane in transport:Prenos (transport) topljenca skozi biološko membrano - pasivni transport - aktivni transport- nekaj primerov *H2O prehaja skozi membrane tudi preko porinov

18. Transport topljencev skozi membrano – vrste transporta olajšana difuzija difuzija primarni aktivni transport Ionofor npr. valinomicin sekundarni aktivni transport ionski kanalček Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

19. Vrste transportnih sistemovglede na število in smer prenešenih molekul Vrsta transporta glede na porabo energije glukoza Na+ • pasivni transport: spontan • tok topljenca v smeri konc. • gradienta • aktivni transport: prehod • topljenca proti konc. gradientu • ob porabi energije Cl- HCO3- glukoza Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

20. Pasivni transport: spontan prehod topljencev skozi prepustno membrano Gibanje el. nabitih topljencev – na prehod skozi membrano vplivata koncentracija in naboj na topljencu. Topljenec prehaja skozi membrano dokler elektrokemijski potencial, topljenca ni enak nič. Gibanje el. nevtralnih topljencev – na prehod skozi membrano vpliva koncentracija topljenca v obeh predelih. Topljenec prehaja skozi membrano, dokler kemijski potencial topljenca ni enak nič.

21. Pasivni transport: energijske spremembe med prehodom hidrofilnega topljenca skozi lipidni dvosloj membrane enostavna difuzija brez transporterja difuzija s transporterjem Membranski proteini znižajo aktivacijsko energijo za transport polarnega topljenca/iona s tem, da ponudijo drugo pot skozi dvosloj za specifični topljenec

22. Pasivni transport hidrofilnega topljenca-membranski proteini – transporterji ali permeaze • Membranski proteini – transporterji - omogočajo prehod topljenca skozi lipidno membrano - olajšana difuzija • Transporterji so široko razširjeni proteini - v človeškem genomu zapis za ~1000 transporterjev • Glede na strukturne in funkcijske lastnosti jih razdelimo v naddružine; znotraj naddružine več družin (podobnost v 3D strukturi). • Glede na mehanizem delovanja razdelimo transporterje: - ionski kanalčki - prenašalci

23. Razdelitev transporterjev transporterji prenačalci kanalčki primarni aktivni transport sekundarni aktivni transport uniporterji

24. Prenašalci Stereospecifična vezava substrata Hitrost transporta manjša kot pri difuziji Pride do nasičenja Običajno monomerni proteini Kanalčki Niso stereospecifični Visoka hitrost transporta (kot pri difuziji) Ne pride do nasičenja Običajno multimerni proteini (pogosto iz ene vrste podenot) Lastnosti transporterjev: prenašalci in kanalčki

25. Pasivni transport, primer 1: prenos glukoze v eritrocit(uniport) Transporter (GLUT 1) – dve konformaci: - T1 z vezavnim mestom proti zunanjosti - T2 z vezavnim mestom proti notranjosti Kinetika prenosa glukoze v eritrocit Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

26. Uravnavanje transporta glukoze preko GLUT4 v miocit in adipocit z inzulinom Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

27. Pasivni transport, primer 2 (antiport): ionski kanalček - izmenjevalec klorida in bikarbonata v eritrocitu Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

28. Pasivni transport: spontan prehod topljencev skozi prepustno membrano Aktivni transport: nespontan prehod topljencev v zgoraj navedenem primeru • topljenec prehaja proti koncentracijskemu/elektrokemijskemu gradientu • poraba energije

29. Aktivni transport • topljenec prehaja proti koncentracijskemu/elektrokemijskemu gradientu • poraba energije Sprememba proste energije pri reakciji S→P Sprememba proste energije pri prehodu nenabitega topljenca iz predela s koncentracijo C1 v predel s koncentracijo C2 Sprememba proste energije pri prehodu ionov proti kemijskemu in eklektričnemu potencialu

30. Aktivni transport Primarni aktivni transport Sekundarni aktivni transport Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

31. Koncentracije ionov v krvni plazmi in v znotraj celic Znotrajcelična tekočina Krvna plazma Koncentracijske razlike različnih ionov znotraj in zunaj celic omogoča aktivni tansport teh ionov

32. Aktivni transport, primer 1: Na+K+ ATPaza v plazemski membrani Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

33. Na+K+ ATPaza - hipotetični mehanizem prenosa Na+ in K+ Na+ K+ Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

34. Aktivni transport: značilnosti transporterjiev - ATPaz • Hidroliza ATP prispeva energijo za črpanje kationov proti koncentracijskemu gradientu • Za prehod kationov je ključnega pomena konformacijska sprememba ATPaze • Konformacijska sprememba – vezava Pi (od tod ime ATPaze tipa P, angl. Phosphate → inhibitor ATPaz je analog fosfata, vanadat) • Različne ATPaze tipa P imajo visoko stopnjo homologije v ak zaporedju, zlasti v bližini Asp ostanka, ki se fosforilira • Vsaka ATPaza tipa P je transmembranski protein • Transporterji tipa P (antiporter za Na+/K+ in uniporter za Ca2+) so zelo razširjeni v živalskem svetu • Vzdržujejo razliko v koncentraciji ionov zunaj in znotraj celice

35. Inhibitorji Na+K+ATPaze tipa Pvanadat in ouabain Ouabain (Somalci uporabljali za zastrupljevanje puščic) – specifični inhibitor Na+K+ATPaze – veže se na encim, odprt proti zunajceličnemu prostoru, in onemogoči konformacijsko spremembo, potrebno za prehod ionov Vanadat, strukturni analog fosfata, tekmuje s fosfatom na ATPazi

36. Aktivni transport, primer 2: črpalka za Ca2+ v sarkoplazmatskem retikulumu • ATPaza tipa P • 1 polipeptidna veriga • 10 x skozi membrano • na citoplazemski strani • veže 2 Ca2+ • hidroliza ATP • konformacijska sprememba • prehod Ca2+ • sprostitev ionov v lumen Vzdržuje nizko koncentracijo Ca2+ v citoplazmi (0,1 M) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

37. Aktivni transport, primer 3: transport glukoze preko epitelijskih črevesnih celic simport glukoze in Na+ uniport glukoze Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

38. Simport glukoze iz intestinalnega lumna v epiteljsko celico Energija, potrebna za ta proces: kemijski potencial (Na+)out>(Na+)in in električni transmembranski potencial F [Na+]out = 145 mM, [Na+]in = 12 mM, ∆E = -50 mV Glukoza se prenaša v celice na račun kemijskega potenciala Na+ in transmembranskega potenciala, dokler ni koncentracija glukoze v celicah 9000 x večja kot v lumnu

39. Akvaporini (AQP)– transporterji vode skozi memebrane (10 različnih akvaporinov pri človeku) Tertamer iz 4 enakih podenot - transmembranskih proteinov - ustvari poro; molekule vode se v kanalčku prehodno vežejo z –H vezmi Veliki –R ak ostankov (Phe, His, Cys, Arg) vzdolž pore dovoljujejo prehod majhnih molekul kot je H2O • v eritrocitu 2 x 105 AQP/celico • pretok molekul vode 109/s • smer odvisna od osmoznega tlaka Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005