المعمل السادس

المعمل السادس صبغ الجراثيم والصبغ المقاوم للأحماض

صبغ الخلايا البكتيرية البكتريا الحية عديمة اللون تقريبا فهي بطبيعتها شفافة لذلك حتى يسهل رؤيتها وفحصها ودراستها مجهريا لا بد من صبغ الخلايا البكتيرية حتى نتمكن من معرفة التراكيب الخارجية مثل الغشاء البكتيري أو التراكيب الداخلية مثل الجراثيم الداخلية والحبيبات المخزنة وغيرها وتستخدم في ذلك أنواع مختلفة من الصبغات منها البسيط ومنها المركب.

صبغ الجراثيم البكتيرية Staining of Bacterial Spores تعتبر الجراثيم البكتيرية ذات أهمية كبرى في التصنيف البكتيري للأنواع المختلفة وعادة تحاط الجراثيم بجدار سميك ومتماسك، والجراثيم الداخلية من المعروف أنها بطبيعتها مقاومة لتقبل الأصباغ فبتالي لا يمكن لطرق الصبغ العادية التي تستعمل في صبغ الخلايا الخضرية للبكتيريا أن تؤدي إلى صبغها، لذلك يستعان بطرق أخرى تستغل الحرارة لتسهيل إدخال الصبغة خلال جدار الجرثومة فإنها تثبت بها ويصعب إزالتها منها، وهنا سيتم صبغ الخلايا البكتيرية بطريقة . Shaeffer & Fulton

طريقة العمل: 1-يحضر غشاء بكتيري من مزرعة بكتيرية عمرها 48 ساعة ثم يثبت الغشاء. 2- عندما تبرد الشريحة يغمر الغشاء بصبغة أخضر الملاكيت وتسخن الشريحة بتعريض سطحها السفلي للهواء الساخن فوق اللهب حتى يتصاعد البخار لمدة من 4-5 دقائق مع مراعاة عدم غليان الصبغة وعدم جفافها. 3-بعد ان تبرد الشريحة تغسل تحت تيار ماء خفيف. وفي كل مره اضيف قطرات من الصبغة حتى لا تجف لمدة 5 دقايق. 4-يصبغ الغشاء بصبغة الصفرانين لمدة دقيقة. 5-يغسل الغشاء تحت تيار ماء خفيف. 6-تترك الشريحة لتجف. 7-يفحص التحضير تحت المجهر باستعمال قوة 10 ثم العدسة الزيتية (قوة 100) وزيت السيدر. لاحظي ظهور الجراثيم الداخلية خضراء اللون في حين أن الخلايا الخضرية المتصلة بالجرثومة تكون حمراء اللون. وضحي موقع الجرثومة وحجمها.(طرفي – تحت طرفي – مركزي ), وحجمها (مساوي أو أقل أو أكبر من قطر الخلية الخضرية )

صبغ الجراثيم البكتيرية Staining of Bacterial Spores http://www.youtube.com/watch?v=mfcFcFNkyAU

صفي مع الرسم أشكال وألوان البكتيريا الظاهرة لديك: النتيجة : ------------------------------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- الرسم :

الصبغ المقاوم للأحماض Acid Fast Stain • - بكتيريا Mycobacterium tuberculosis التي تسبب مرض السل ذات خواص طبيعية او كيميائية يصعب صبغها بالطرق العادية • - اذا تعرض الغشاء للحرارة خلال الصبغ لمدة طويلة نسبيا فإنة يصعب ازالة الصبغة حتى لوغسلت بالكحول المحمض بHCL فتعرف بأنها مقاومة للأحماض Acid fast وبالتالي تحتفظ بصبغة كربولالفوكسين وتظهر الخلايا حمراء اللون • - البكتيريا الغير مقاومة للأحماض Non-acid fast تزال منها الصبغة خلال الغسيل بالكحول المحمض وتتلون بالصبغة العكسية ( مثل ازرق الميثلين) • - الطريقة المستخدمة للصبغ Ziehl & Neelsen

طريقة العمل: • يحضر غشاء من المزرعة البكتيرية الحديثة ثم يثبت • يغمر الغشاء بصبغة كربولالفوكسين ويسخن السطح السفلي للشريحة حتى يتصاعد منها البخار ( دون غليان الصبغة) لمدة من 3-5 دقائق ( عدم جفاف الصبغة) • تغسل الشريحة تحت تيار ماء خفيف • يضاف الكحول المحمض على الغشاء نقطة فنقطة تدريجيا مع امالة الشريحة حتى تسقط القطرات عديمة اللون • يغسل الغشاء تحت تيار ماء خفيف • يصبغ الغشاء بصبغة ازرق الميثلين لمدة دقيقة (الصبغة العكسية ) • يغسل الغشاء تحت تيار ماء خفيف • تجفف الشريحة ثم تفحص تحت المجهر

الاختلاف بين البكتيريا المقاومة للاحماض والغير مقاومة للاحماض - يرجع السبب الاساسي للاختلاف الى وجود تراكيز مرتفعة من الدهون في الاغشية السيتوبلازمية لخلايا البكتيريا المقاومة للأحماض، وهذه الدهون تمنع او تؤخر دخول الصبغة او خروجها - ويعتقد ان وجود حمض الميكوليكMycolic acid في البكتيريا المقاومة للأحماض بنسبة كبيرة من اسباب ايجابيتها http://www.youtube.com/watch?v=tfnpezgBSiI

صفي مع الرسم أشكال وألوان البكتيريا الظاهرة لديك: النتيجة : ------------------------------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- الرسم :

شكراً لإستماعكم أ.الدانهالقحطاني.

المعمل السادس