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Richiami di Bioenergetica

Richiami di Bioenergetica. Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare col Potenziale Elettrochimico. Il Potenziale Elettrochimico è l’Energia disponibile nelle Reazioni Chimiche per compiere Lavoro. Potenziale Elettrochimico. m. J/Mol. Unità = Energia/Mole. Dm o = D G o /mol.

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Richiami di Bioenergetica

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Presentation Transcript

  1. Richiami di Bioenergetica

  2. Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare colPotenzialeElettrochimico Il Potenziale Elettrochimico è l’Energia disponibile nelle Reazioni Chimiche per compiere Lavoro

  3. Potenziale Elettrochimico m J/Mol Unità = Energia/Mole Dmo=DGo/mol

  4. L’Energia in una Reazione 1 A + 1 B 2C In generale: Dm = SNimprodotti – SNimreagenti Ni = Rapporto Molare dei Reagenti Per la nosra particolare reazione: Dm = 2mC – 1mA– 1mB

  5. All’Equilibrio: Dm = 0 Energia del Sistema Equilibrio

  6. Per una Reazione che va verso l’Equilibrio: Dm < 0 Energia del Sistema Dm Dm Equilibrio

  7. Il PotenzaleElettrochimico è la risultante di diversi fattori: 1) Composizione Molecolare 2) Concentrazione 3) Potenziale Elettrico 4) Pressione Osmotica, …

  8. Energia dovuta alla Composizione Molecolare mo • Energia Conformazionale • Energia Entropica contro Stabilità dei legami • Solubilità-Interazione con il Solvente • Coefficiente di Partizione • Misurata in Condizioni Standard

  9. Condizioni Standard Le Condizioni Standard sono le condizioni della reazione appropriate per l’esperimento con i reagenti ad una concentrazione Molare: • Concentrazione 1 Molare • In Acqua Pura • pH=7 • Pressione = 1 atmosfera

  10. Energia di Concentrazione • L’Energia del Gradiente di Concentrazione: = RT ln([C]/Molare) R = Costante dei Gas (Joules*Mole-1*K-1) T = Temperatura (Kelvin, K)

  11. Energia del Potenziale Elettrico • L’Energia dovuta alle cariche in un Campo Elettrico: = z F y z = Cariche (Moli di Carica/Mole) y = Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica) V = J/C F = Costante di Faraday: 105 Coulomb/Mole di Carica

  12. Potenziale Elettrochimico [Conc] [Conc]o m = mo + RT ln + zFy [Conc]o è la Concentrazione in CondizioniStandard

  13. All’Equilibrio: A B Dm = mB – mA= 0 Cambiamento Conformazionale = (moB +RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) (moB + RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) = 0 -RT ln ([B]) + RT ln ([A]) = moB – moA = Dmo

  14. A B Cambiamento Conformazionale All’Equilibrio: (moB + RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) = 0 = Dmo -RT ln ([B]/[A]) -RT ln ([B]) + RT ln ([A]) Risolvendo rispetto a: [B]/[A] = exp (-Dmo/RT) = Keq Distribuzione diBoltzmann

  15. Modello di Gating del Canale

  16. Le particelle di gating agiscono all’interno della proteina-canale con modalità interpretabili in termini di una distribuzione di Boltzmann. Consideriamo un sistema a due stati nel quale ciascun canale è aperto dal movimento di una singola particella di gating di carica z Secondo il modello di H&H un unico movimento della particella di gating causato da una variazione del campo elettrico provoca un cambiamento conformazionale del canale: + + Barriera energetica Energia   Voltaggio-dipendenza del gating Le posizioni  e  corrispondono a due minimi nel profilo energetico e vi è una singola barriera energetica tra di esse. In una popolazione di N canali simili, n1 avranno la loro particella di gating in posizione  e n2 in posizione , cosicchè n1+n2=N.

  17. k cost. di Boltzmann T temp. assoluta u2-u1 è espressa in joules Energia D u Stato 1 Stato 2 Equazione di Boltzmann della meccanica statistica Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato  o nello stato  con le differenze di energia u2-u1=Du dei due stati: La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore

  18. 1o caso: il campo elettrico transmembrana è zero In assenza di campo elettrico (E=0) la distribuzione di Boltzmann dell’energia della popolazione di molecole sarà: Dove: n1il no di particelle con energia u1 in posizione (1) (canale chiuso) n2il no di particelle con energia u2 in posizione (2) (canale aperto), u2-u1 è la variazione di energia libera (DG) relativa al cambio conformazionale da 1 a 2 Quindi, in assenza di un campo elettrico la differenza di energia conformazionale (u2-u1) tra le posizioni 1 e 2 corrisponde al lavoro chimico (w) per muovere ciascuna particella di gating da 1 a 2.

  19. 2o caso: il campo elettrico transmembrana è  da zero Se esiste un campo elettrico (E0) la componente energetica posseduta dalla particella in quanto elettricamente carica sarà: -zeV z no di cariche in ciascuna particella di gating e carica elementare dell’elettrone (=4.8·10-10 ues=1.6·10-10 coulomb V potenziale elettrico Quindi, includendo la componente di energia (lavoro) elettrica, avremo: Se nel nostro sistema il canale è aperto quando la particella di gating è in (2) e chiuso quando è in (1), la frazione di canali aperti è anche uguale alla frazione di particelle in (2):

  20. Fraz. di canali aperti Po Ritorniamo all’equazione: Ponendo si ottiene: dove V1/2 è il voltaggio V al quale metà dei canali sono aperti (Po=0.5). L’equazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in un grafico lineare di Po in funzione di V. Quanto più elevata è z tanto maggiore è la pendenza della curva Notare che quanto più è elevata la carica z, tanto maggiore è la pendenza della curva Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per muovere ciascuna particella di gating dalla posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di energia tra le due posizioni in assenza di un potenziale di membrana.

  21. Fittando i dati sperimentali di H&H per il Na e per il K con l’equazione si ottiene z(K)3.9 e z(Na) 4.8 Gmax 2.5 1 2.0 ) S o t m r ( e a 1.5 p z a n e a l t 0.5 a t 1.0 u n d a n c o . b 0.5 C o r P 0 0 -80 -60 -40 -20 0 20 40 Voltaggio (mV) Z=4.8 (Na) Z=3.9 (K)

  22. Che significato ha il valore di z? • Semplicemente potrebbe essere la quantità di carica mossa da un lato all’altro della membrana durante il processo di gating. • Potrebbero però esistere più particelle di gating per canale. Per esempio con quattro particelle che si muovono indipendentemente, il valore di z ottenuto applicando la precedente equazione si riferirebbe a ciascuna singola particella e la carica di gating per l’intero canale sarebbe 4z.

  23. Alcune definizioni….. Dmo=DGo/mol F/RT=eo/kT R=8.3143 joule·K-1·mol-1 k=1.38054·10-23 joule·K-1 R=NA·k (6.0222·1023 mol-1·1.38054·10-23 joule·K-1) NA≡Numero di Avogadro: n. di molecole contenute in una mole (6.0222·1023mol-1) F=96490 C·mol-1 V=statVolt (299.8 volt)=erg/ues=10-7 joule/0.333 ·10-9 C eo≡carica elementare dell’elettrone (0.16022 ·10-18 C)

  24. A 0 mV L’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Attivato rispetto a quello chiuso e non dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che non c’è un gradiente di potenziale elettrico.

  25. m(C)=mo(C) m(C)=mo(C) m(A)=mo(A) m(A)=mo(A) + EM + 0 mV Energia EM Nessun Effetto EM Nessun Effetto C Bagno m (Gate) = zG· F · 0 mV = 0 Membrana A m (Gate) = zG· F · 0 mV = 0 Distribuzione di Boltzmann Basata solo su Dmo Citoplasma

  26. A -70 mV L’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Chiuso e dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che c’è un gradiente di potenziale elettrico.

  27. mo(C) mo(A) m(A) m(C) + EM + -70 mV Energia EM Stabilizzante EM Destabilizzante C Bagno m (Gate) = zG· F · 0 mV = 0 Membrana A m (Gate) = zG· F · -70 mV < 0 La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo stato C Citoplasma

  28. a +40 mV L’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Attivato e dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che c’è un gradiente di potenziale elettrico.

  29. m(C)=mo(C) m(C) m(A)=mo(A) m(A) + EM + +40 mV Energia EM Stabilizzante EM Destabilizzante C Bagno m (Gate) = zG· F · 0 mV = 0 Membrana A m (Gate) = zG· F · 40 mV > 0 La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo Stato A Citoplasma

  30. Il gating dei canali voltaggio-dipendenti ovvero Come fa il voltaggio ad aprire i canali? Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling

  31. Canali ionici voltaggio-dipendenti Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM) Questa è una delle 4 (pseudo)subunità H5 Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P) I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio Vi appartengono: Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+ Canali del K+ Ca2+-attivati Canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.

  32. X 4

  33. 2 2 5 4 4 5 Attiva la spirale Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer

  34. Il movimento del sensore del voltaggio, facendo aprire il canale, produce una corrente ionica +50 mV -100 mV Corrente Ionica 1000 pA

  35. 10 pA 1 ms Il movimento del sensore del voltaggio produce anche una corrente di gating +50 mV -100 mV Corrente Ionica 1000 pA come è possibile smascherare la corrente di gating? Corr. di Gating Soluzione senza K+

  36. Il movimento del sensore del voltaggio produce una corrente di gating +50 mV -100 mV Ig = dqg/dt  qg = ∫Igdt 10 pA Corr. di Gating 1 ms Soluzione senza K+ Carica totale di gating = cariche elementari/canale Numero dei canali

  37. Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica 1 2 3 4 5 6 7 IL R VI R LV R VF R IF K LS R HS K GL 4 R  K 2 R  neutral AA  q/n 0 - (e charges) -2 -4 K=lisina R=arginina

  38. Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica 1 2 3 4 5 6 7 IL R VI R LV R VF R IF K LS R HS K GL 4 R  K 2 R  neutral AA  q/n 0 - (e charges) -2 -4

  39. Nel canale del K+ “Shaker” la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la “ripida” dipendenza dell’attivazione del canale dal voltaggio. • Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte: • Prima indipendentemente l’una dall’altra; • Poi in maniera cooperativa, portando all’apertura.

  40. MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pdf MacKinnon_Nature01581.pdf

  41. Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix La visione del tetramero del canale K+ è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 a-eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N-terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K+. Le eliche S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K+ sono colorati in verde.

  42. Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)

  43. Conformazioni delSensore del Voltaggio • Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+. Chiuso: Vr=-100 mV

  44. Conformazioni delSensore del Voltaggio • Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui 196-199 comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+. Aperto: depolarizz.

  45. Lo stato chiuso prevale al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV). • Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana. • In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.

  46. Ingrandimento del Sensore del Voltaggio • Una Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata l’ossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche l’ossatura del filtro di selettività e gli ioni K+. chiuso

  47. Ingrandimento del Sensore del Voltaggio aperto • In aggiunta al movimento della “paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra l’Asp 80 e l’Arg 133.

  48. Accessibilità deiResidui • Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno. Interno

  49. Accessibilità deiResidui Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso. Esterno

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