1 / 46

4. Kultivierung von MO

4. Kultivierung von MO. pH-Wert pH 7 = 10 -7 mol/l H + pH 5 = 10 -5 mol/l H + bei pH 5 die [H + ] verdoppeln: -log (2*10 -5 ) = pH 4,7 pH Meter: pH Elektrode elektrochemische Potentialmessung hohe Genauigkeit. 4. Kultivierung von MO. pH-Wert pH 7 = 10 -7 mol/l H +

margie
Download Presentation

4. Kultivierung von MO

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 4. Kultivierung von MO • pH-Wert • pH 7 = 10-7 mol/l H+ • pH 5 = 10-5 mol/l H+ • bei pH 5 die [H+] verdoppeln: -log (2*10-5) = pH 4,7 • pH Meter: • pH Elektrode • elektrochemische Potentialmessung • hohe Genauigkeit

  2. 4. Kultivierung von MO • pH-Wert • pH 7 = 10-7 mol/l H+ • pH 5 = 10-5 mol/l H+ • Indikatorfarbstoffe • rel. ungenau • auf Stäbchen aufgebracht – Mischung verschiedener Farbstoffe

  3. 4. Kultivierung von MO • pH-Wert • Puffer: • wässrige Lsgen von Substanzen oder Substanzgemischen, die Wasserstoff bzw. Hydroxidionen abfangen oder nachliefern können, wodurch der pH-Wert in bestimmen Grenzen gehalten werden kann • nach Puffertabellen (zB.: Geigy oder Küster, Thiel: Rechentafeln für die Chemische Analytik, De Gruyter) werden Puffergemische hergestellt (2 bis 4 verschiedene Lsgen) • für verschiedene pH Werte unterschiedliche Pufferlösungen • für Nährböden oft anorganische Phosphate • org. Pufferbestandteile können von MO abgebaut werden (bspw. Citrat oder Acetat)

  4. aus: Geigy: Wissenschaftliche Tabellen

  5. 4. Kultivierung von MO • Gefäße – Laborglasware • Schottflaschen: • Nährmedienherstellung mit Dispenser • Aufbewahrung (Schraubverschluss) • NICHT geeicht • Erlenmeyerkolben • Nährmedienherstellung • Kulturgefäß: erleichtert Gasaustausch (aerob) • „Allzweckglas“ • NICHT geeicht

  6. 4. Kultivierung von MO • Gefäße – Laborglasware • Schottflaschen: • Nährmedienherstellung mit Dispenser • Aufbewahrung (Schraubverschluss) • NICHT geeicht • Erlenmeyerkolben • Nährmedienherstellung • Kulturgefäß: erleichtert Gasaustausch (aerob) • „Allzweckglas“ • NICHT geeicht

  7. 4. Kultivierung von MO • Gefäße – Laborglasware • Messzylinder • auf „ex“ geeicht • Zugabe eines bestimmten Volumens • Messkolben • auf „in“ geeicht • zur Herstellung definierter Lösungen (z.B. „molare Lsgen“ (1 M KH2PO4)) • einwiegen und bis zur Marke auffüllen

  8. 4. Kultivierung von MO • Gefäße – Laborglasware • Pipetten: • Glaspipetten (Skalierung), Messpipetten • Vollpipetten (ähnlich Messkolben mit einer Marke) • Kolbenhubpipetten mit Plastikspitzen

  9. 4. Kultivierung von MO • Gefäße – Laborglasware • Glasqualität: • verschiedene Sorten/Qualitäten • Borosilicatglas am besten geeignet • Markennamen: Pyrex, Duran, Solidex • hohe chemische Beständigkeit • sehr hitzebeständig (bis zu 200 °C bei dickwandigen Gefäßen) • Quarzglas: • Photometrie: UV-Durchlässigkeit bis 180 nm

  10. 4. Kultivierung von MO • Gefäße – Kulturgefäße

  11. 4. Kultivierung von MO • Herstellung von Agarplatten • Einwiegen der NM Bestandteile • Zugabe von Wasser • (ev. zum vollständigen Lösen erwärmen bzw. aufkochen) • Zugabe von Agar • Nährboden (Nährmedium mit Agar) wird autoklaviert • (ev. im Wasserbad/Wärmeschrank bei ca. 50°C warmhalten) • NB wird unter aseptischen Bedingungen in sterile Petrischalen gefüllt („gegossen“) - LF • Agarplatte = eine Petrischale mit ca. 20 ml Nährboden • Platten abkühlen lassen damit der Agar fest wird • Petrischalen beschriften (Unterseite) • zur weiteren Bearbeitung fertig • Aufbewahrung im Kühlschrank (4 °C Raum)

  12. 4. Kultivierung von MO • Herstellung von Schrägagarröhrchen • Einwiegen der NM Bestandteile • Zugabe von Wasser • (ev. zum vollständigen Lösen erwärmen bzw. aufkochen) • Zugabe von Agar • Nährboden (Nährmedium mit Agar) wird autoklaviert • (ev. im Wasserbad/Wärmeschrank bei ca. 50°C warmhalten) • NB wird unter aseptischen Bedingungen in sterile Röhrchen gefüllt: ca. 5 bis 10 ml je Röhrchen • auf Ablage schräg ablegen (z. B. auf Pipette o.Ä.) • abkühlen lassen • beschriften • zur weiteren Bearbeitung fertig • Aufbewahrung im Kühlschrank (4 °C Raum)

  13. 4. Kultivierung von MO • Abfüllen von NL • Herstellung des gewünschten Vol. an NL • Abfüllen in entsprechende Kulturgefäße (z.B. Erlenmeyerkolben, Eprouvetten) • Kolben mit Wattestopfen verschließen, Eprouvetten mit Überwurfkappe • Watte mit Alufolie abdecken • autoklavieren • abkühlen lassen (ev. im kalten Wasserbad) • Lagerung auf 4°C • (bei Platzmangel wird das gesamte Vol autoklaviert, gelagert und erst bei Bedarf in separat sterilisierte Gefäße abgefüllt)

  14. 4. Kultivierung von MO • Impftechniken • „beimpfen“ = Übertragung einer gewissen Menge an lebens- und vermehrungsfähigen Materials (MO) in ein geeignetes Medium • „Inokulum“ = vermehrungsfähige Mikroorganismen, susp. • als Inokulum kommen Reinkulturen auf Agarplatte oder NL, aber auch Mischkulturen (meist in NL) in Frage • Größe des Inokulums kann variiert werden (Fragestellung) • für Reinkulturgewinnung: wenig Inokulum auf Impföse auf eine Agarplatte überimpfen • Anreicherung von MO: z.B. over-night Kultur als Versuchsvorkultur • Zugabe einer definierten Menge mit definierter Zell- oder Keimzahl (z.B. aus Vorkultur)

  15. 4. Kultivierung von MO • Impftechniken • Grundregeln: • Arbeiten unter dem Laminar-Flow (aseptische Bedingungen, Personenschutz) • Kulturgefäße (inkl. Inhalt) müssen steril sein • Arbeitsgerät muß steril sein (Impföse, Spartel,…) • Kulturgefäße werden vor dem Überimpfen mit Inhalt (NL), Kulturname und eigenem Namen versehen (wasserfester Stift !!!) • nach Lagerung im Kühlschrank sollte NL angewärmt werden (je nach Org.) • niemals in Gefäße greifen, immer am unteren Rand anfassen • beim Überimpfen ruhig und sicher arbeiten

  16. 4. Kultivierung von MO • Impftechniken • Arbeitsgeräte

  17. 4. Kultivierung von MO • Impftechniken • Arbeitsgeräte

  18. 4. Kultivierung von MO • Impftechniken • Ausglühen der Impföse/ -nadel

  19. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • statische (batch) Kultur • wird einmal angesetzt und stellt damit ein geschlossenes System dar • z.B.: in einen EK mit 100 ml NL wird E. coli überimpft und 10 Tage inkubiert • relativ einfach und im normalen Laboralltag weit verbreitet • z.B. für Vorkulturen • kontinuierliche Kultur • im Chemostaten • nach Maßgabe wird Medium nachgefüttert, der pH Wert korrigiert o.Ä. • kein geschlossenes System • oftmals aufwändig, relativ lange Vorbereitungszeiten • im Normalfall aber recht gut reproduzierbar

  20. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Temperatur • jeder MO hat eine optimale Wachstumstemp. (jene Temp. mit der maximalen Wachstumsrate) (z.B. E. coli 37 °C, B. stearothermophilus 55 °C, B. psychrophilus 18 °C) • ABER: Wachstumsbereich (z.B. E. coli zw. 30 und 37 °C) • van‘t Hoffsche Regel: eine Erhöhung der Temp. um 10°C (unterhalb des Optimums!!!!) bewirkt eine (ca.) Verdopplung der Wachstumsrate bei den meisten Bakterien (Anhalt) • Bebrütungstemp. hat nicht nur Auswirkung auf Wachstumsrate, sondern z.B. auch auf die chemische Zusammenseztung von Zellen (Bsp. Serratia marcescens: Einlagerung von rotem Pigment bei 30°C, weißliche Kultur bei 37°C)

  21. Serratia marcescens bei 30 inkubiert Serratia marcescens bei 37 inkubiert

  22. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Temperatur • mesophil: max. Wachstumsrate bei 20 bis 42°C • thermotolerant: Wachstum bis 65°C • thermophil: Max. WR bei 42 bis 70°C • extem thermophil/hyperthermophil: Wachstum bis zu 100°C • psychrophil/kryophil: Temp. Optimum unter 20°C und Minimum bis zu -5°C

  23. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Temperatur • meist mesophile Organismen: 30 °C • Meschen-/Tierpathogene: bei 35 – 37 °C • Bodenmikrooganismen: bei 20 bis 25 °C • Pilze (inkl. Hefen): 20 bis 25 °C • Inkubation in Temperaturschränken (Heiz-/Kühlschrank), aber auch im Wasserbad

  24. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Licht • chemotrophe Org. brauchen kein Licht für ihr Wachstum (Energie kommt aus der Oxidation org/anorg. Substrate, sondern kann ev. schädigen (Photooxidation) • chemotrophe Org. werden im Dunkel inkubiert • Phototrophe: Licht als (Haupt-)Energiequelle • Sporulation: für manche Pilze wird zur Induktion der Sporulation Licht eingesetzt

  25. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • strikt aerob: atmen O2 (Elektronenakzeptor) wachsen bei O2 Konz. der Luft (21%) (z.B. Azotobacter, Pseudomonas): • mikroaerophil: atmen O2, wachsen jedoch nur bei niedrigeren O2 Konz. <21% (z.B. Campylobacter) • strikt anaerob: O2 kann zur Energiegewinnung nicht verwendet werden (toxisch) (z.B. Clostridium, Desulfovibrio) • aerbotolerant: Wachstum mit und ohne O2, Energiegewinnung jedoch ausschließlich durch Gärung (z.B. Milchsäurebakterien) • fakulativ anaerob: Wachstum mit und ohne O2, können zwischen Atmung und Gärung umschalten

  26. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • Oberflächenkultur: • auf Agar: ausreichende O2 Versorgung, Austrocknung • Zweiphasenkultur: • Agarplatte mit Flüssigkeit überschichtet • Deckenkultur: • Wachstum als Haut an der Oberfläche (v.a. Pilze, schleimbildende MOs) • stehend inkubieren

  27. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • Submerskultur: • submers = „untergetaucht“ • MOs werden in Flüssigkeit subspendiert (und meist geschüttelt) • je größer die Phasengrenzfläche, desto mehr O2 löst sich in der Flüssigphase • Schütteln: Rundschüttler (kreisförmig), Längsschüttler (hin-her), Over-head Schüttler (kreisförmig über Deckel) • Rühren • Art des Gefäßes (Schikanen) • Einleiten von Luft

  28. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • Submerskultur: • Löslichkeit von O2 in wässrigen Lsgen abhängig von: • Temperatur • Salzkonzentration • bei 30°C sind ca. 7 mg O2 gelöst (0,22 mmol) = für die Oxidation von ca. 6,5 mg Glk notwendig

  29. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff

  30. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • mikroaerobe Inkubation • bei O2 Gehalten zw. 1 und 15 % (v/v) • Kultivierung auf halbfesten NB (ca. 4 g Agar) • „Stichagar“: durch die Schichtung im Agar entsteht ein Gradient in der O2 Konz. und die Org. wachsen an jenen Stellen, die für sie die richtige O2-Konz. bereitstellen • Kultivierung im Anaerobiertopf mit Gasphasengeneratoren auf herkömmlichen festen Agarplatten (ca. 20 g Agar)

  31. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • mikroaerobe Inkubation • fakultativ anaerobe MO

  32. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • mikroaerobe Inkubation • fakultativ anaerobe MO

  33. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • anaerobe Inkubation • Produkte des molekularen Sauerstoff toxisch (z.B. H2O2) • große Unterschiede in der Sauerstoffempfindlichkeit (Methanosarcina thermophilia > Clostridium tetani > Clostridium acetobutyricum) • Redoxpotential (E`0 [mV]): • Standard NL: ca. +400 mV hpts. durch das Redoxsystem ½ O2 + 2 e-→ O2- • Methanogene wachsen erst ab ca. -250 bis -300 mV

  34. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • anaerobe Inkubation • Redoxpotential: • durch Aufkochen einer NL wird O2 aus dem Medium getrieben • Restsauerstoff: Zugabe eines reduzierenden Stoffes: L-Cystein, Na-Thioglycolat, Na-Sulfid • Redoxindikatoren: Methylenblau (E`0 = +11 mV), Resazurin (E`0 = -51 mV), Phenosafranin (E`0 = -252 mV)

  35. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • anaerobe Inkubation • Arbeiten mit Anaerobiern: • NM autoklavieren und schnell abkühlen (ohne zu schütteln) • Nährböden schnell verwenden und im Anaerobiertopf inkubieren • flüssige NM für strikte Anaerobier mit Widdelkolben abfüllen

  36. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • anaerobe Inkubation • Anaerobiertopf:

  37. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • anaerobe Inkubation • Widdelkolben:

  38. 4. Kultivierung von MO • Bebrütung – Inkubation • Einflussfaktor Sauerstoff • anaerobe Inkubation • Arbeiten mit Anaerobiern: • Wright-Burri Röhrchen

  39. 5. Anreicherung und Isolierung • MO kommen in der Natur fast ausschließlich als Mischpopulationen vor • viele unterschiedliche MO bzw. Stämme mit einer Vielzahl an physiologischen Voraussetzungen • für eine aussagekräftige Beschreibung von MO ist in der Regel eine Reinkultur notwendig • sind in einem Habitat nur geringe Abundanzen des Zielorganismus‘ zu finden, so muss eine Anreicherungskultur angelegt werden, die Bedingungen schafft, welche den Org. physiologisch bevorzugen

  40. 5. Anreicherung und Isolierung • Anreicherungskultur: • setzt Kenntnis über Zielorganismus voraus • als geschlossenes System: batch-Ansatz • zumeinst in synthetischem Flüssigmedium – erleichtert die Manipulation (z.B. Austausch eines Salzes oder einer C-/N-Quelle) • Inokulation mit der Probe (Bodenextrakt, Schlamm etc.) • Medium richtet sich nach den Rahmenbedingungen der Probe (Bodenprobe mit tiefem pH Wert – Medium mit niedrigem pH Wert etc)

  41. 5. Anreicherung und Isolierung • Beispiel Anreicherungskultur: • Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio • zu finden in Sedimenten, eutrophen Gewässern, Faulschlamm, Abwasserleitungen (!!) • benötigt div. Endprodukte anaerober Abbauwege als Elektronendonatoren und C-Quellen • Sulfat als Elektronenakzeptor • es bildet sich H2S • anaerobe Bedingungen • niedriges Redoxpotential E`0 = < -100 mV

  42. 5. Anreicherung und Isolierung • Beispiel Anreicherungskultur: • Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio • Herstellen eines NB mit Salzen, Laktat, Hefeextrakt und FeSO4 • zum NB eine sterilen Eisennagel (ausglühen) zugeben (senkt das Redoxpotential) • z.B. in Wright-Burri Röhrchen füllen • mit z.B. Sediment inokulieren • einige Tage bei 30°C inkubieren • Auswertung: • Kulturen durch deutlich schwarz-Färbung erkennbar • sitzen oft auf Eisennagel (schwarzer Belag) • Mikroskop: kleine gekrümmte Stäbchen, g- • Geruch nach Schwefelwasserstoff (!!!!)

  43. 5. Anreicherung und Isolierung • Beispiel Anreicherungskultur: • Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio Wasserstoffver-brauch lässt Röhrchen (b) absinken, bzw. drückt NL in Flasche II (d)

More Related