Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Blut von Patienten mit Harnblasenkarzinom

1. Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Blut von Patienten mit Harnblasenkarzinom Uta Schmidt1, Udo Bilkenroth2 , Katja Robel1, Clemens Linné1, Ulrike Heberling1, Susanne Füssel1, Oliver W. Hakenberg1, Axel Meye1 , Manfred P. Wirth1 1Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden, 2Institut für Pathologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

2. Einleitung • Obwohl das Harnblasenkarzinom eine der häufigsten Malignitäten ist, ist wenig über den Zeitpunkt und die benutzten Wege der Tumorzelldisseminierung bekannt • Hofmann et al. (2003) konnten eine Korrelation zwischen der Inzidenz von CK-18-Zellen im Knochenmark und invasivem Karzinom, Lymphknotenbeteiligung, mittel- bis hochgradig entdifferenziertem Karzinom und Progression zeigen • Für Longitudinalstudien zur Ermittlung der Effektivität einer bestimmten Behandlungsform ist Knochenmark aber nicht so einfach und wiederholt zugängig wie peripheres Blut

3. Einleitung • Uroplakin II, CK 20 und hTERT wurden als urothelspezifische Marker am häufigsten in RT-PCR-Studien verwendet • Desgrandchamps et al. (1999) beschrieben eine Anreicherung von Tumorzellen mit Hilfe eines Antikörpers, der CK 8, CK 18 und CK19 erkennt, fanden unter 33 Patienten aber nur einen mit disseminierten Tumorzellen, der zum Zeitpunkt der Analyse schon radiologisch nachweisbare Metastasen hatte • Allard et al. (2004) beschrieben ein Zwei-Schritt-Verfahren zur Anreicherung von disseminierten Tumorzellen aus Blut und deren Nachweis in allen getesteten Blutproben

4. Einleitung • Durch eine umfassende Studie beim Mammakarzinom konnte die Nützlichkeit der Quantifizierung von DTZ mit Hilfe des Zwei-Schritt-Anreicherungsverfahrens für die Vorhersage des Progressionsrisikos und des Gesamtüberlebens gezeigt werden (Cristofanilli et al. 2004) • Fehm et al. (2002) wiesen mittels FISH nach, dass zirkulierende epitheliale Zellen maligne sind und vom Primarius abstammen  Anwendung der Depletionsstrategie zur Quantifizierung von DTZ im Blut von Patienten mit BCa und Korrelation mit klinisch-pathologischen Parametern

5. Material • 208 Blutproben von 101 Patienten mit BCa aller Stadien (Median: 2 Proben pro Patient, 1-11 Proben) • Alter der Patienten: 68 Jahre (35-90 Jahre) • Proben wurden in Behandlungsgruppen zusammengefasst: - transurethrale Resektion (TUR-Gruppe) - Zystektomie (CE-Gruppe) - systemische Chemotherapie (CT-Gruppe) • 4 Patienten hatten TUR und Zystektomie, 1 Patient hatte TUR und Chemotherapie, 6 Patienten hatten Zystektomie und Chemotherapie, 1 Patient hatte TUR, Zystektomie und Chemotherapie  die Proben dieser Patienten wurden den entsprechenden Gruppen zugeteilt, d.h. diese Patienten erscheinen in mehr als einer Behandlungsgruppe

6. Methoden I • MACS-Prozedur • peripheres Blut (16ml EDTA-Blut) • Ficoll-Gradientenzentrifugation (650g, 20min) • Waschen und Zentrifugation der MNZ • Leukozytenmarkierung (40µl CD45-Microbeads; 15min, 4°C) • autoMACS (Miltenyi Biotec), “deplete sensitive”-Modus • Zytospinzentrifugation der CD45- Zellpopulation (1 Objektträger) • Immunzytochemie (anti-CK-AK MNF116, Dako) • Pathomorphologische Begutachtung:Nachweis & Quantifizierung von disseminierten Tumorzellen • Vergleich mit klinischen Daten der betroffenen Patienten

7. Immunmagnetische Zellsortierung (MACS) CD45+ CD45- markierte MNZin 1 mL PBS Methoden II

8. Methoden III FISH (UroVysion) 1. Entdeckeln der Objektträger nach Immunzytochemie, Äquilibrieren in 2xSSC bei 37°C 2. Pepsin-Verdauung bei 37°C für 15min 3. Waschen in PBS bei Raumtemperatur, aufsteigende Ethanolreihe (70%, 85% and 100%) 4. Denaturierung in 2xSSC/70% Formamid bei 73°C für 5min 5. Zugabe der fertigen FISH-Sonden (UroVysion), Eindeckeln, Verschließen mit Fixogum 6. Übernachtinkubation in feuchter Kammer bei 37°C 7. Entdeckeln der Objektträger, Waschen in 0.4xSSC/0.3% NP-40 bei 73°C für 2min 8. Spülen in 2xSSC/0.1% NP-40 9. DAPI-Gegenfärbung, Eindeckeln 10. Mikroskopische Begutachtung (Fluoreszenz) mit speziellen Filtern für Spektrum Rot (Chr.3), Spektrum Grün (Chr. 7), Spektrum Gold (9p21), Spektrum Aqua (Chr. 17) und DAPI

9. a b Ergebnisse Beispiele von mit pan-anti-CK immunzytochemisch gefärbten DTZ a) Zelle von Patient 469 (pT2a pNx M1 G3, Chemotherapie) mit CK-Färbung b) Zelle von Patient 428 (pT3 pN0 M0 G3, vor TUR) ohne CK-Färbung, aber mit anormaler Morphologie Vergrößerung 400x

10. a b c d e f g h i j Ergebnisse Beispiele von mit UroVysion FISH-behandelten DTZ a-e) Patient 24 (pT1 pN0 M0 G2, nach TUR) f-j) Patient 374 (pT4 pN1 M0 G3, Chemotherapie) a, f) Chromosom-3-Signale in Rot und Chromosom 7 in Grün b, g) 9p21-Signale in Gold c, h) Chromosom-17-Signale in Aquablau d, i) DAPI-Kernfärbung e, j) Stapel aller Einzelbilder Vergrößerung 400x

11. Ergebnisse • 64/208 (31%) Proben enthielten DTZ, nach den Ergebnissen der Immunzytochemie und/oder aufgrund einer abnormen zellulären Morphologie geurteilt • 34/104 (33%) Proben von Patienten, die sich einer TUR der Blase unterzogen, enthielten DTZ. Teilt man die Proben in prä- und postoperativ gewonnene, so sank der Probenanteil mit DTZ nach TUR (33% vs. 24%) • 11/39 (28%) Proben von Patienten, die sich einer radikalen Zystektomie unterzogen, enthielten DTZ. Teilt man die Proben in prä- und postoperativ gewonnene, so sank der Probenanteil mit DTZ nach Zystektomie, d.h. 6/17 (35%) Proben enthielten DTZ vor Zystektomie wohingegen nur 4/19 (21%) DTZ danach enthielten •Anteil positiver Proben in der Chemotherapie-Gruppe: 14/58 (24%).

12. Ergebnisse • 7/ 21 (33%) Patienten in der Chemotherapie-Gruppe hatten 1 positive Probe, 2 (10%) hatten 2 positive Proben und 1 Patient hatte 3 positive Proben. Trotzdem hatte kein Patient ausschließlich positive Proben. Das trifft auch auf die Patienten zu, deren Proben aufgrund verschiedener Behandlungen zu unterschiedlichen Gruppen zugeordnet wurden. Strategie nicht zum Monitoring geeignet, da nur bei 10/21 CT-Patienten DTZ nachgewiesen, und davon bei 7 nur einmal • Zellzahlen pro positiver Probe (median): TUR prä: 3 TUR post: 4 ZE prä: 5 ZE post: 2.5 CT: 6.5

13. Schlussfolgerungen • Anteil DTZ-positiver Proben nimmt unter chrirurgischer Intervention (TUR, Zystektomie) ab, bleibt aber unter zytotoxischer Chemotherapie konstant • BCa disseminieren zeitig • Notwendigkeit einer effektiven Behandlung bei Erstdiagnose