Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von Proteinen

1. Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von Proteinen von Tim Grotjohann Veranstalter Lehrstuhl für Genetik Universität Bielefeld

2. Inhaltsübersicht: • Allgemeines zum Protein-Blot • Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese • Blottingmembranen • Gel-Blot • 1) Wet-Blot • 2) Semi-Dry-Blot • 3) Transferpuffer • Dot-Blot • Färbeverfahren für transferierte Proteine

3. Allgemeines zum Protein-Blot • Definition: beim Protein-Bloting werden Proteine auf eine Membran übertragen und dort einer spezifischen Nachweisreaktion unterzogen • DOT-Blot: Proteine werden direkt auf die Membran getüpfelt • Gel-Blot: Übertragung von Proteinen, die zuvor in einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt wurden • die Membran: sie dient als Trägermatrix für die Proteine, auf der diese immobilisiert sind und sich somit leichter handhaben lassen • Western-/Immuno-Blotting: mittels einer spezifischen Antikörperreaktion lassen sich hiermit bestimmte Proteine identifizieren, die Molmassen dieser bestimmen oder auch die Spezifität eines Antikörpers bestimmen • es gibt noch weitere Verfahren, bei denen die Fähigkeit von Proteine ausgenutzt wird, an andere Moleküle zu binden (North-Western-Blotting, South-Western-Blotting, Virus-Overlay,…)

4. Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese • Proteinaufreinigung: durch Degradierung von Proteinen können weitere Banden auf dem Gel entstehen – so kann es beim Kochen der Probe in SDS- und alkanolaminhaltigem Probenauftragspuffer zur Fragmentierung von Proteinen kommen  deswegen wird eine Erhitzung auf lediglich 60°C für ca. 10-30 Minuten empfohlen • Gelelektrophorese: Je dünner das Gel, desto effizienter ist der Transfer – deshalb sollten Gele eine Dicke von 2mm möglichst nicht überschreiten

5. Blottingmembranen • Nylon: • hohe Proteinbindekapazität • besonders für das Blotten von sauren Proteinen oder bei Chemoluminiszenznachweisen • benötigt spezielle Blockingreagenzien (Casein und Polyvinylpyrrolidon) • Polyvinylidenfluorid (PVDF): • hohe Proteinbindekapazität (bis 600µg/cm²) • gute Resistenz gegen organische Lösungsmittel • gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis bei Chemolumineszenz-Detektionssystemen

6. Blottingmembranen • Nitrocellulose (NC): • Bindekapazität von 180µg/cm² • kleine Porengröße von 0,025µm • günstiger als PVDF • beim Dot-Blot vorwiegend verwendet, da diese Membran eine hohe Saugfähigkeit hat

7. Gel-Blot • Der Transfer muss direkt nach der Auftrennung der Proteine erfolgen • Transfer-Methoden: • Diffusions- und Vakuumtransfer finden eher bei der Arbeit mit nativen Gelen ihre Verwendung • Als Standardverfahren hat sich der elektrophoretische Transfer durchgesetzt  im Folgenden werden exemplarisch die elektrophoretischen Verfahren „Wet-Blot“ uns „Semi-Dry-Blot“ vorgestellt

8. Gel-Blot • Vorteile des Semi-Dry-Blots sind die höhere Transfergeschwindigkeit und die sehr viel geringere Menge an verwendetem Transferpuffer • Der Wet-Blot hingegen ist schonender durch bessere Kühlmechanismen Wet-/Tank-Blot Semi-Dry-Blot

9. Gel-Blot – 1)Wet-Blot 1) Wet-Blot - + Gel Membran Schwammtuch Kunstoffgitter Filterpapier

10. 2) Semi-Dry-Blot 2kg - Gel Filterpapier Membran +

11. 3) Transferpuffer • grundsätzlich gibt es mehrere Alternativen • Er darf keine stark leitenden Salze enthalten, da diese zu hohen Strömen führen, was einen schlechten Transfer und eine Überhitzung der Apparatur zur Folge hat • der Puffer muss keinen exakten pH-Wert aufweisen (alle Werte zwischen 7,3 und 11 sind akzeptabel) • Er enthält 0- 20% Methanol, welches die Membran benetzt und so die Proteinbindung erleichtert, sowie die SDS-Bindungen lockert

12. Dot-Blot • Hierbei wird auf die gelelektrophoretische Trennung verzichtet und die Proteine direkt auf die Membran getüpfelt • Hauptanwendungsgebiete: • -immunchemische Quantifizierung kleinster Proteinmengen • -Detektion bestimmter Proteine aus einem Proteingemisch • -Bestimmung von Nachweisgrenzen von Detektionssystemen • -bei Verwendung von Proteinen mit sehr hoher/kleiner Molmasse, oder solchen, die durch die Elektrophorese beschädigt würden, oder durch ihre hohe Ionenstärke die Trennung stören würden • nur dann anwendbar, wenn monoklonale Antikörper oder Proben mit nur einem Protein verwendet werden

13. Färbeverfahren für transferierte Proteine • Die Effizienz eines Blotvorgangs lässt sich mit unspezifischen Proteinfärbemethoden bestimmen: • Ponceau-S-Färbung: • geeignet für NC und PVDF • Nachweisgrenze bei 5-15ng Protein/mm² • kolloidales Gold: • geeignet für NC und PVDF • Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm² • benötigt abgesättigte Membran • neigt zu irreversiblen Bindungen

14. Färbeverfahren für transferierte Proteine • -Fluorophore: • -geeignet für NC und PVDF • -Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm² • -benötigt aufwändige optische Ausrüstung • -Direktblau 71: • -geeignet für NC und PVDF • -Nachweisgrenze bei 0,5-1,5ng Protein/mm² (NC) • bzw. 1-3ng Protein/mm² (PVDF) • -hohe Kontrast