1 / 21

Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA

Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA. Michal Jurajda ÚPF. Odběr materiálu pro izolaci RNA. Problém „biologicko-vědecký“ Problém technologický Problém organizační. Problém „biologicko-vědecký“. Co? Proč? Jak? Kdy?. Získávání materiálu. Přímo v laboratoři

meghan
Download Presentation

Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA Michal Jurajda ÚPF

  2. Odběr materiálu pro izolaci RNA • Problém „biologicko-vědecký“ • Problém technologický • Problém organizační

  3. Problém „biologicko-vědecký“ • Co? • Proč? • Jak? • Kdy?

  4. Získávání materiálu • Přímo v laboratoři • Ve zdravotnickém zařízení • Tkáňové banky a archivy preparátů

  5. Zpracovávaný materiál • Buněčné kultury • Čerstvá tkáň • Tkáň z tkáňových bank z parafinových bločků

  6. Obecné poznámky • RNázy jsou stabilní, velice aktivní a nevyžadují kofaktory • Obecně potřeba pracovat v čistším prostředí než při izolaci DNA

  7. Požadavky na odběr • Uchování co největšího množství RNA – snaha uchovat intaktní bb. až do lýzy ve speciálním pufru. • Uchování expresního profilu – okamžité usmrcení bb. a stabilizace RNA.

  8. Postup práce • Odběr, transport, stabilizace • Odběr,stabilizace, transport • Lýza • Homogenizace • Izolace RNA • Stabilizace (-80 nebo liqN2) • Reverzní transkripce + real-time PCR

  9. Postup práce • Postupné zpracovávání • Dávkové zpracování

  10. Technologie odběru • Transport in vivo • Okamžitá izolace RNA

  11. Technologie odběru • Odběr ve zdravotnickém zařízení • Stabilizace vzorku • Kultivační medium + okamžitý transport • Snap-frozen, N2, ultralow freezer • RNAlater • PAXgene

  12. Technologie izolace • Příprava vzorku • Zamražené nerozpouštět • Lýza buněk • Lytické pufry obsahují inhibitory RNáz • Homogenizace • Mechanické rozbití makromolekul • Izolace RNA „no proteins = no RNA-ses“

  13. Praktická realizace Fázová separace Selektivní vazba Centrifugace Vývěvy Manuální systémy Automatické systémy

  14. Kritické kroky • Stabilizace kvantity i kvality RNA v tkáňovém vzorku • Uchování izolované RNA • Uchování cDNA ????

  15. Organizační problémy • Specializovaní pracovníci popřípadě zaškolení stávajících pracovníků • Přístrojové vybavení (low freezer, N2) • Evidence vzorků a rychlá komunikace

  16. Řešení ?

  17. Řešení AMBION RNAlater, RNAwiz, ToTALLY RNA QIAGEN PAXgene System, RNAeasy MRC TRI reagent Appliedbiosystems Total RNA Isolation Chemistry, ABI 6100

  18. Řešení AMBION RNAlater 500ml 310€ ToTALLY RNA 100ml (pro 10g tkáně) 276€ + plastik RNAwiz 100ml 144€ + plastik + chloroform + isopropanol

  19. Řešení QIAGEN PAXgene System (Tubes+Kit) 100 izolací 25 000Kč + 2x 12 900 Kč RNAeasy mini kit 250 izolací 29 000Kč

  20. Řešení MRC TRI reagent 500ml 50g tkáně/166ml krve 418$/455$ + plastik

  21. Co? • Proč? • Jak? • Kdy?

More Related