Masterseminar – Marc Müller

1. Analyse der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase-Aktivität und der IMPDH1-Genexpression in den Lymphozyten von Mycophenolat-Mofetil-behandelteN NierenPatienten Masterseminar – Marc Müller 6. November 2013

2. Inhalt 1 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere 1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien 1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) 2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente 2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

3. 1 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/

4. 1 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere Lokalisierung und Besonderheiten: • Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links • Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung • Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte Einmündung der Nierenarterie Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter physiologische Hauptaufgaben: Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite (= glomeruläre Filtration) Regulation des Wasserhaushalts ↔Blutdruck Regulation der Elektrolytkonzentrationen Gluconeogenese Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D)

5. 1 Grundlagen 1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands Exemplarische Nephropathien • diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes • Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren) • Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch) • Fehlbildungen der Nierengefäße • Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom) • … Datenquelle:

6. 1 Grundlagen 1.2 Einblick in die aktuelle nephrologischeStatistik Deutschlands • Inzidenz: 210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche Gesamtbevölkerung) • Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5): • 0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung • einer von 1000 Bürgern GFR = glomeruläre Filtrationsrate Datenquelle:

7. 1 Grundlagen 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Nierentransplantation Dialyse / Blutwäsche Quelle: Fresenius Medical Care AG

8. 1 Grundlagen 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Problematik: • Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger • Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie • Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger Lösung: Rejektionsprophylaxedurch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie → gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers Nierentransplantation

9. 1 Grundlagen 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Wichtige immunsuppressive Medikamente • Azathioprin • Prodrug→ Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert diese zu 6-Mercaptopurin • 6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der DNA-/RNA-Synthese • Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten

10. 1 Grundlagen 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Wichtige immunsuppressive Medikamente • Calcineurin-Inhibitoren • z.B. Ciclosporin • Hemmung der Phosphatase Calcineurin • dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells) Quelle: C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin complex.. Nature, 378, 641-644.

11. 1 Grundlagen 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Wichtige immunsuppressive Medikamente • Mycophenolat-Mofetil (MMF) • Prodrug • 2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA) • selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) • Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B- und T-Lymphozyten ein inaktive Prodrug (MMF) aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA)

12. 1 Grundlagen 1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie

13. 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat- Dehydrogenase (IMPDH) 2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente IMPDH-abhängige Oxidation von IMP zu XMP Angriffspunkt für immunsuppressive MMF-Therapie nach einer Nierentransplantation Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie

14. 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat- Dehydrogenase (IMPDH) 2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung • Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLCnach Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat • RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography Quelle:chem.uft.uni-bremen.de

15. 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat- Dehydrogenase (IMPDH) 2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis):

16. 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens • beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2) • mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt → alternatives Splicing der mRNA! Quellen: Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism National Human Genome Research Institute

17. 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens Ziel: Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik • Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität • Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-Immundiagnostik • Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -regulation • … Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

18. 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

19. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Bei Fragen: fragen!