Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

2. Sběr materiálu na izolaci DNA • Obecné zásady: • v principu je možné použít kteroukoli část rostliny (i dřevo) • ideální je čerstvý materiál • problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy) • brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů • sbírat pokud možno zdravou tkáň (neinfikovanou ostatními organismy) • sběr omezit radši na jeden typ tkáně • výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně (např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP) • zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)

3. Fixace materiálu před izolací • Vysoušení • silikagel–asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem) • při pokojové teplotě (nebo v sušárně) – taky funguje, vhodné např. pro mechorosty, lišejníky; ale herbářové položky rostlin mohou být problematické • vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku • vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě

4. Fixace materiálu před izolací • Nakládání do ethanolu • asi není moc výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy) • Zamrazováním čerstvého materiálu • bez problémů, ale není nutné

5. Vlastní DNA izolace • Volba extrakční metody • jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství • kolik máme peněz a času: komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie) dražší (40-100 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.) ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky) čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou

6. Vlastní DNA izolace • Kroky izolace DNA: • rozrušení buněčné stěny - homogenizace materiálu • lyze buněčných membrán -pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA) • odstranění kontaminantů: • proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších... • fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny, • které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce • huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání • polysacharidy • RNA • čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě

7. Vlastní DNA izolace Homogenizace materiálu - mechanicky: • větší kousky tkáně v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné) • nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2) • drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem

8. Vlastní DNA izolace • Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak: • sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu • střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice) • Nevysušený materiál: • je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami) • pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty

9. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • NaOH metoda • velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!) • zvýšené pH denaturuje kromě DNA i proteiny (DNazy), a pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně a supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl) • vhodné i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů • nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR; omezená trvanlivost? • vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat ELFO ani spektrofotometricky

10. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • CTAB extrakce • NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) • CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí RNA • CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě • přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci: ◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat ◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny) (krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)

11. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • CTAB extrakce • přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu) pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením bílý DNA pelet (zabarvení značí nečistoty) • DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolema rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku • vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA • zabere ~4 h a víc

12. Vlastní DNA izolace • Příklady klasických protoklů izolace DNA: • SDS extrakce • izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) • po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy) • vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem • RNasa A rozštěpí RNA • podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA • výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie • izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)

13. Vlastní DNA izolace 1 2 3 • Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA: • lyzační fáze, odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany, ošetření RNasou A • navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice) • za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu • DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem) • uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou - objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí) • koncentrace získané DNA ale často nižší! • existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA

14. Vlastní DNA izolace • Skladování DNA: • čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě • TE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů) • krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC • roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození) • nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování (používat alikvoty) • DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě

15. Kontrola kvality a kvantity DNA • 1) pomocí spektrofotometru • A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin) • přístroj měří ~ 5 µl vzorku • vlastní hodnota A260 by měla být v rozmezí (0.01-)0.1-1.0 (jinak výpočty nepřesné, dá se ovlivnit ředěním vz.) • z ní přístroj vypočítá koncetraci (nutno brát s rezervou) proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8 (absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá) A320: mělo by být blízké 0 jiné hodnoty indikují znečištění, a odhad koncentrace DNA je nadhodnocený (poměrně časté např. u CTAB izolace) c [ng/µl] = 50 x A260 x dilution factor (pro odstranění efektu kontaminantů lze od A260 odečíst A320, a teprve výsledné číslo dosadit do vzorce – může pak vyjít i záporná koncentr.) A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů ... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)

16. Kontrola kvality a kvantity DNA nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1µl) • 2) fluorimetricky • barvivo selektivní pro DNA (např. ethidium bromid, PicoGreen) • přesné stanovení koncentrace DNA: není ovlivnění kontaminanty, ale nezjistíme jejich přítomnost!

17. Kontrola kvality a kvantity DNA • 3) elektroforéza (ELFO) • pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru • vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku) • záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace

18. Kontrola kvality a kvantity DNA • 3) elektroforéza (ELFO) • vlastní vizualizace DNA: • fluorescenční barviva, které se vážou na DNA – potenciální mutageny • UV transluminátor – ethidium bromid (EtBr, asi mutagen), Sybr Green, Gel Red ... • modré světlo – Sybr Green, Sybr Safe • barvivo možné přidat do gelu nebo loading bufferu, ale způsobuje posuny a deformace bandů(kromě Sybr Safe); stačí pro hrubou kontrolu DNA ◄produkty restrikce PCR produktu: Sybr Green přidán do loading bufferu, stejné fragmenty migrují rozdílně (ovlivněno koncentrací DNA) • nebo obarvením gelu v roztoku barviva po dojetí forézy (post-staining) - dražší, ale nejvíc senzitivní a nezpůsobuje deformace a posuny bandů

19. Kontrola kvality a kvantity DNA • ELFO genomové DNA • fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny) • pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce! • ... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci) čistá, kvalitní DNA: ◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA ◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací) smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA

20. Kontrola kvality a kvantity DNA Příklad rozdílné efektifity izolačních metod:kořeny Festuca rubra, PCR amplifikace DNA mykorhizních hub (AMF) MoBio Soil Kit kvalitní, čistá DNA, ale malý výtěžek, nutné použít >15 mg kořenů Qiagen Plant Kit dostatek DNA, ale nepoužitelné, zbarvený izolát, inhibuje PCR CTAB izolace dostatek DNA, ale nepoužitelné, silně zbarvený izolát, inhibuje PCR CTAB izolace + purifikace MoBio CleanUp kitem ztráta části DNA, ale PCR funguje (na další 4 druhy Poaceae ze stejné lokality stačí klasická CTAB izolace)

21. Kontrola kvality a kvantity DNA • Co s herbářovým materiálem? • recentní položky (<15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžnou PCR, ale může se velmi lišit druh od druhu! • u staršího materiálu nutno vyzkoušet, nadějnější jsou klasické protokoly (CTAB, SDS; asi ale nemá cenu NaOH) • pozor na kontaminaci recentním materiálem! • např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým materiálem • u mechů a lišejníků patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi! • při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem • výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu • doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček