Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 8 . Mikrosatelity

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 8. Mikrosatelity Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

2. Mikrosatelity - úvod Mikrosatelity (SSR = Simple Sequence Repeat; STR = Short Tandem Repeat; SRS = Simple Repetitive Sequence) • jeden z tzv. variabilních repetitivních DNA sekvencí (VNTR = Variable Number Tandem Repeat) • jednotkou je opakující se sekvenční motiv = repetice, např. (CA)n: CTTGGCGAGCACACACACACACACACACACGGTGACATCTCC • mono-, di- (AT, AG), tri- (GAA, AGT),... až hexanukleotidy • variabilní počet opakování motivu: ~3-100 • motivy >10 repetic obvykle vysoce variabilní

3. Mikrosatelity - úvod Další typy repetitivních sekvencí: satelity – dlouhé motivy (2-)100-300(-několik tisíc) bp, velký počet opakování motivu (1000-100000 a více); okolí centromér chromozomů, tvoří heterochromatin minisatelity – středně dlouhé motivy ~10-60bp, menší počet opakování (~20-50); subtelomerní (koncové) části chromozomů nebo centromery; využití - RFLP genomové DNA a hybridizace s minisatelitní sondou, nebo arbitrární PCR s primery s minisatelitním motivem – obdoba ISSR) minisatelit mikrosatelit

4. Mikrosatelity - úvod Charakteristika • u rostlin jsou nejčastější motivy (A)n, (AT)n, (CA)n, (GA)n, (GAA)n • převážně jaderné, A/T motivy i v chloroplastu (ale nižší variabilita) • klasifikace repeats: • simple perfect – čisté opakování motivu, ideální případ (viz výše uvedené příklady) • imperfect (interrupted) – např. (GT)3A(GT)6 • compound– např. (GA)4N12(CA)8

5. Mikrosatelity - úvod Charakteristika • vysoce variabilní → populační genetika, studie blízce příbuzných taxonů, detekce klonality • jaderné SSR jsou kodominantní → přesný odhad frekvence alel • vysoce specifický marker pro určitý druh nebo skupinu druhů • vysoce reprodukovatelné • krátká délka → umožňuje analýzu i u nekvalitního nebo starého (herbářového) materiálu s fragmentovanou DNA • cena analýzy: zhruba > ISSR, << AFLP

6. Mikrosatelity – princip metody Provedení metody • PCR amplifikace konkrétního SSR lokusu: nutné znát primery z okolí SSR – tzv. flanking regionu: forward primer ► forward primer reverseprimer ◄ reverse primer • délka amplikonů jednotlivých lokusů obvykle 100-500 bp • volena tak, aby se lokusy navzájem co nejvíce lišily

7. Mikrosatelity – princip metody Provedení metody • délková variabilita výsledného PCR produktu odráží počet opakování motivu (repetic) • v minulosti vizualizace např. denaturační PAA elektroforézou: PAA(data z 1 lokusu)

8. Mikrosatelity – princip metody Provedení metody • délková variabilita výsledného PCR produktu odráží počet opakování motivu (repetic) • v současnosti obvykle pomocí fragmentační analýzy – PCR s fluorescenčně značenými primery: lokus 3 lokus 1 lokus 2 FA - 3 barevně odlišené lokusy (+ červený size standard)

9. Mikrosatelity – princip metody PCR se značenými primery: • specifický forward primer syntetizován v fluorescenčně značené modifikaci • nebo M13 universal tail protokol (není nutné draze značit jednotlivé forward primery daných SSR lokusů samostatně; univerzální značené primery lze použít na jakékoli druhy organismů) • PCR s 3 primery: • specifický forward primer na 5´ konci s M13 universal tail sekvencí • druhý forward M13 primer s fluorescenční modifikací • reverse primer bez modifikace M13 tail sekvence sekvence specifická pro daný lokus v prvních cyklech PCR je Ta nastavena tak, aby u forward primeru nasedala pouze jeho specifická část ... v pozdějších cyklech PCR je Ta snížena a na M13 tail produktu nasedá druhý forward primer – M13 sfluor. modifikací ... ve výsledné směsi pak převládají produkty sfluor. značeným koncem Schuelke M. 2000. An economic method for the fluorescent labeling of PCR products. Nat. Biotechnol. 18: 233-234.

10. Mikrosatelity – princip metody Provedení metody • amplifikace lokusů daného vzorku smíchány (pool), každý vzorek analyzován fragm. analýzou na kapilárním sekvenátoru • nepodceňovat barevný design analýzy – barvy pro jednotlivé lokusy rozvrhnout tak, aby bylo možné do jedné fragm. analýzy zahrnout (optimálně) všechny analyzované lokusy: • sekvenátory obvykle umožňují detekci 4 různých fluor. barev (např. 6- FAM, VIC, NED, PET) • lokusy s nápadně odlišnými délkami lze značit stejnou barvou • délkově blízké/překrývající se lokusy nutno barevně odlišit! ... a ještě 1 červený lokus = celkem 11 lokusů v jedné F. A. plus 3 modré lokusy... plus 2 černé (= žluté) lokusy... 5 zelených lokusů...

11. Mikrosatelity – princip metody Provedení metody • možnost tzv. multiplex PCR: v jedné reakci namíchány primerové páry pro vícelokusů → každý pár naamplifikuje specificky svůj lokus • může značně šetřit čas a peníze • primerové páry se ale nesmí příliš lišit parametry PCR amplifikace (teplota nasedání primerů, délka elongace apod.) • při použití M13 tailu dávat do multiplexu jen lokusy značené stejnou barvou! • existují komerční PCR mixy specializované pro multiplex PCR 100 bp ladder ◄ multiplex. amplifikace 3 SSR lokusů (Spergularia echinosperma, P. Kúr) ◄ ◄

12. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel: • u diploidů (nebo haploidní fáze živ. cyklu) lze přesně odečíst, které alely (=délkové varianty) jsou v genomu přítomny • nutné znát délku repetice (mono-, di-, tri- atd. nukleotid) • zohlednit tzv. stutter bands: artefakty PCR, sklouzáváním polymerázy (polymeráza ale nejčastěji tvoří fragmenty správné délky → převládají nad artefakty); ztěžují interpretaci lokusů s >~20 repeticemi fragmentační analýza: PAA gel: alela alely: 161+161 alela * SB (stutter bands) SB SB SB SB SB SB SB SB SB vzdálenost Stutter Bands = délka repetice, např. 2bp

13. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel: • u diploidů (nebo haploidní fáze živ. cyklu) lze přesně odečíst, které alely (=délkové varianty) jsou v genomu přítomny • nutné znát délku repetice (mono-, di-, tri- atd. nukleotid) • zohlednit tzv. stutter bands: artefakty PCR, sklouzáváním polymerázy (polymeráza ale nejčastěji tvoří fragmenty správné délky → převládají nad artefakty); ztěžují interpretaci lokusů s >~20 repeticemi homozygot je, když: nápadně nejvyšší pík je napravo, reálná alela = nejvyšší pík alely: 161+161 (stutter bands) vzdálenost stutter bands = délka repetice, např. 2bp ostatní patterny → heterozygot!

14. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel: heterozygot: reálné alely jsou dva nejvyšší píky alely: 152+160 ! heterozygot: reálné alely jsou dva nejvyšší píky vpravo(alely se liší o délku depetice – 161 a 163; delší 163 svými stuttery navyšuje píky směrem nalevo) alely: 161+163

15. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel: • u některých lokusů mohou být A-produkty: terminální transferázová aktivita Taq polymerázy → na konec PCR produktu přidává A homozygot (A-produkty) nemůže být druhou alelou heterozygota: nesedělo by násobkům dinukleotidové repetice!!! alely: 151+151 +A (2bp) (vzdálenost A-produktů od alely příp. klasických stutter bands = 1bp) alely: 161+163 (pro srovnání - heterozygot bez A-produktů) (2bp)

16. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel – komplikace & artefakty: • u vyšších ploidií častonemožné přesně odečíst konstituci alel např. když u tetraploida vidíme 2 alely - 160 a 162, tak může být: 2x(160)+2x(162) 3x(160)+162 160+3x(162) • výška píků pro určení poměru alel příliš nepomůže – někdy ovlivněna stuttery sousední alely, nebo poměr alel vychýlen PCR bias: tetraploidní data – Euphrasia (Š. Svobodová): * * * * * * (SB) ideální případ – zřejmě 4 různé alely zřejmě 2 alely, ale jejich relativní zastoupení v genotypu nelze interpretovat (nesedí na 2:2, ale ani na 3:1) • skóruje se např. jako dominantní (absence/presence, matice 0/1)

17. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel – komplikace & artefakty: • allelic dropout: jedna z alel heterozygota se nenaamplifikuje = jedinec se jeví jako homozygot dropout alely 149 příčiny: • nízká kvalita templátové DNA • PCR bias - preferenční amplifikace (obvykle kratší) alely • u problematických vzorků se vyplatí analýza replikátů PCR - testování error rate, poolování replikátů daného lokusu před fragm. analýzou redukuje PCR bias • nulové alely: mutace v místě nasedání primerů → žádný PCR produkt, nebo allelic dropout některé z alel Pompanon F. et al. 2005. Genotyping errors: Causes, consequences and solutions. Nature Reviews Genetics, 6: 847-859.

18. Mikrosatelity – princip metody Odečítání SSR alel – komplikace & artefakty: • ´stegosaur´ alely s velkým počtem repetic (ca >20-30): výrazné a četné stuttery → obtížné stanovení velikosti alely • pull-up peaks: intenzivní amplifikace jedné barvy ´vytahuje´ zdánlivou amplifikaci dalších barev (kopírují i její stutter pattern!) Selkoe K. A., Toonen R. J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, 9: 615-629.

19. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? • z publikací nebo databází: x předpokladem je, že někdo už s daným organismem pracoval • pokud není dostupné přímo pro náš cílový organismus, můžeme zkusit primery navržené pro příbuzné druhy = cross-species amplification • pokusit se vyvinout vlastní, tzv. izolace SSR

20. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Cross-species amplification: • s rostoucí evol. vzdáleností klesá úspěšnost • obvykle nutná optimalizace podmínek PCR, ne všechny lokusy se podaří naamplifikovat, případně neamplifikují všechny vzorky = nulové alely • i pokud primery amplifikují, může mít lokus např. sníženou variabilitu: primery izolované z mechu Scorpidium cossonii –např. lokus (GT)16: testován u Hamatocaulis vernicosus – nedostatečná variabilita, pouze 5 repetic:

21. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Izolace SSR: • několik různých protokolů • tvorba SSR-enriched genomic library (obohacené knihovny) • pomocí AFLP markerů • pomocí ISSR markerů • z EST library – expressed sequence tag: total mRNA → cDNA → hledání SSR a design primerů SSR z okolí kódujících oblastí → větší šance na úspěšnou cross-species amplification • možné využít i komerční služby • vše většinou relativně finančně náročné (~40 tis. Kč a více)

22. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Příprava SSR-enriched genomic library Izolace většího množství (~10-20 µg) kvalitní genomové DNA Restrikce genomové DNA na fragmenty které lze sekvenovat (~500-1000 bp) + restr. enzym Na konce fragmentů navázány ligací krátké dsDNA fragmenty (linkery) s arbitrární sekvencí - umožní pozdější PCR amplifikaci a ligaci při klonování + T4 ligáza, linkery

23. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Příprava SSR-enriched genomic library K fragmentům přidána biotinylovaná sonda nesoucí určitý SSR motiv → naváže se (hybridizuje) na fragmenty s daným SSR motivem teplotní denaturace + sonda Magnetické mikročástice (beads) pokryté streptavidinem → vazbou streptavidin-biotin vychytají fragmenty se SSR → vlastní SSR-enriched library (obohacená knihovna) + roztok streptavidin-coated beads separace magnetem odsátí roztoku

24. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Zpracování SSR-enriched genomic library PCR amplifikace fragmentů enriched library (sekvence linkerů slouží jako PCR primery) a jejich klonování → separace jednotlivých molekul Klony screenovány sekvenací (případně předběžné ověření Southern blotting s příslušnou SSR sondou, nebo PCR s primerem nesoucím SSR motiv) Design primerů, jejich PCR testování - zda netvoří nulové alely, zda jsou dostatečně variabilní…

25. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Vypadá to (relativně) snadně, ale: • ne všechny SSR sondy na daný organismus fungují... • jen zlomek (~5-15%) fragmentů obohacené knihovny nese skutečně SSR... • část SSR nepoužitelných - příliš krátké nebo naopak příliš dlouhé, případně složité compound motivy... • ne pro všechny fragmenty se podaří nadesignovat primery... • ne všechny navržené primery skutečně fungují na vzorcích ...

26. Jak získat sekvence mikrosatelitních primerů? Komerční služby: • např. osekvenování celého cílového genomu pomocí 454-pyrosekvenování (~30 tis. Kč, ale cena 1 sekvence je ~200x nižší než při klasickém sekvenování Sangerovou metodou): • získá se velké množství (desítky tisíc) sekvencí o délce ~550 bp, zlomek z nich obsahuje SSR • nebo stejným způsobem osekvenovat vlastní SSR-enriched library (efektivnější než sekvenace genomu - vyšší výtěžek SSR fragmentů) • firmy často poskytnou i navržené primerové kombinace

27. Chloplastové mikrosatelity (cpSSR) • obvykle opakování jedné báze, větš. A / T • roztroušeně v cp genomu; poly-A/T úseky v sekvencích… • chloroplastový genom obecně stabilnější než jaderný → „univerzální“ cpSSR primery (funkční minimálně pro příbuzné druhy, někdy ale i mezi čeleděmi) • Mutační rychlost v řádu 10-5 / generace • u jaderných mikrosatelitů více, ale odhady se různí (10-5 – 10-3) • u jiných nekódujících chloroplastových úseků méně (10-9) • Využití pro „středně“ rychlé procesy • Haploidní → 1/2 efektivní velikost populace, citlivé na gen. drift • původ / fylogeneze / hybridizace příbuzných druhů • vnitrodruhová variabilita (fragmentace popul., fylogeografie,…) • …a spousta studií na užitkových rostlinách

28. Vyhodnocení mikrosatelitových dat • Kodominantní • základní statistiky viz přednáška allozymy • počet alel, polymorfní lokusy,… • podíl heterozygotů, He, HW rovnováha,… • Nulové alely • mutace v místě nasedání primerů • nevzniká žádný produkt, jedinec hodnocen jako homozygot • podhodnocení počtu heterozygotů • lze odhalit jen při křížení / analýze potomstva

29. Vyhodnocení mikrosatelitových dat • U vyšších ploidií problém s určením počtu alel heterozygotů • AAAB vs. AABB vs. ABBB • prakticky nelze z intenzit píků / proužků! • Co s tím? • kódovat přítomnost / nepřítomnost alely = binární data • ztráta informace • za předpokladu allotetraploidie a pokud převažují vzorky s 1-2 alelami kódovat jako diploida • automaticky předpokládá AABB • problém, pokud jsou 3- nebo 4-alelické vzorky • možné zkreslení výsledků • pravděpodobnostní výpočty, odhady frekvence alel • např. program ATETRA

30. Mutační modely • Diferenciace mezi populacemi – analogie FST, výpočet gene- tických vzdáleností,… • Infinite alleles model (IAM) • všechny alely rovnocenné, stejná rychlost jejich tvorby • stejně dlouhé alely homologické (identity by descent, IBD) • toto se používá také pro isozymy, ISSR, AFLP,… • Stepwise mutation model (SMM) – nejčastěji používaný • alely vznikají postupně mutacemi o 1 krok (repetici), stejná rychlost v obou směrech (prodloužení × zkrácení) • alely s podobnou délkou jsou si příbuznější • možná homoplazie, alela vzniká přidáním nebo zkrácením (identity in state, IIS) • koeficient RST, resp. jeho odhad ρST,distance D1, Da, (δμ)2 • Two-phase model (TPM) • změna o jednotku rychlostí p, o více jednotek rychlostí 1-p

31. …(AT)8… …(AT)7… …(AT)8… …(AT)8… …(AT)8… …(AT)7… …(AT)8… …(AT)8… …(AT)9… …(AT)8… …(AT)9… IBD IIS IIS Mutační modely • Identity by descent (IBD) • Stejně dlouhé alely jsou homologické (od společného předka) • Identity in state (IIS) • Stejně dlouhé alely nejsou homologické (nemají spol. předka)

32. dvě populace Cymodoce nodosa Arnaud-Haond et al. 2005J. Heredity 96: 434-440 Identifikace klonů • Multilokusové genotypy, shoda = klon (?) • výpočet pravděpodobnosti, že stejný genotyp vznikle nezávisle pohlavním rozmnožováním • statistika PSEX (PGEN) (Parks & Werth 1993, Am. J. Bot.) • počítáno z frekvence alel a polymorfních lokusů a počtu vzorků • klony = pouze pokud PSEX < 0.05 (nebo jiná hranice) • clonal diversity: R = (G – 1) / (N – 1) (pro 1 klon pak vyjde 0) • Různá rozlišovací síla • počet lokusů • jejich variabilita (počet a frekvence alel)

33. Populační studie – ochranářská Betty & Provan 2011, Ann. Bot. 107: 663–670 • Monotropa hypopitis v Sev. Irsku • 8 lokusů, průměr 14 alel / lokus • F-statist., AMOVA, určení klonů • překvapivě velký počet klonů, malý podíl vegetativního rozmn. • FIS: v některých populacích hodně autogamie • He: ochuzení proti střední Evropě • mírná diferenciace mezi populacemi → nemíchat materiál, outbreeding depression struktura populace, pole = 10 cm

34. Populační studie - invazní Huotari et al. 2011, Plant Syst. Evol. 294: 27-37 • Elodea canadensis ve Finsku • předpoklad: klonální (dvojdomý, vv Evropě chybí ♂), 1 zavlečení • 7 popul., 10 lokusů, 2-5 alel / lokus • zákl. statistiky, RST, pairwaise FST,AMOVA, STRUCTURE • 181 vzorků / 80 multi-locus genotypes • skoro 80% variability uvnitř populací, diferenciace mezi pop., potvrzuje i STRUCTURE (2 hlavní skupiny) • rozdíly proti americkým populacím (někt. lokusy se ani neamplifikují) → možná relativně rychlá evoluce • vícenásobné zavlečení × evoluce somatickými mutacemi ?

35. Klonalita + rozmnožovací systém Zipperle et al. 2011, Ann. Bot. 107: 127–134 • porost Zostera noltii na pří-livových plošinách v Baltu • trvalka, ale velký obrat ramet a náhrada ze semen • hermafrodit, hydrogamní, předpokládáno opylovánív rámci „fleku“ (klonu) → inbreeding • plocha 100m2, 256 plodných lodyh, analýza dosp. + semena • 9 lokusů, klonální struktura, F-statist., hetero-zygozita, původ semen (MLTR, Cervus)

36. Klonalita + rozmnožovací systém Zipperle et al. 2011, Ann. Bot. 107: 127–134 • vysoká míra cizosprášení (~ 90%), zbytek převážně auto- a geitonogamie, velmi málo biparental imbreeding (opylení od jiného, ale příbuzného jedince) • semena v rámci květenství většinou mají různé otce • ale jen 50% vajíček je oplodněno – vysvětlováno obecně nedostatkem pylu (třeba 104-105 zrn na jedno vajíčko) • efektivní vzdálenost šíření pylu je pouze několik m • dále je v článku diskutován vliv režimu disturbancí na rozmnožování a přežívání populace…

37. Hybridizace Snow et al. 2010, Am. J. Bot. 97: 2061–2067 • Typha latifolia (pův.), T. angustifolia (pův?, zavlečená), T. ×glauca (invaz) v Americe • kříženec údajně sterilní, silně klonální • starší studie 30 druhově specifických RAPD,nyní 9 SSR primerů, 7 druhově (±) specifické • FST, STRUCTURE, morfometika • F1 hybridi kombinují alely od obou rodičů • existují zpětní hybridi (→ není to sterilní) • potvrzuje i morfologie

38. Vývoj areálu / fylogeografie Kuss et al. 2011, Persp Plant Ecol. Evol. Syst. 13: 101–110 • Campanula thyrsoides v Alpách, 2 poddruhyJV Alpy × zbytek (S obvod Alp) • 51 populací, 5 lokusů • populační variabilita, STRUCTURE, AMOVA,výpočet hranic v programu Barriershttp://www.mnhn.fr/mnhn/ecoanthropologie/software/barrier.html • zjištěny 3 významnější zlomy v geneticképodobnosti namapování gen. nepo-dobností sousedů výběr nejvyšší hodnoty,protažení hranice kokrajům; další kolo,… bootstrap (100 matic)

39. Vývoj areálu / fylogeografie Kuss et al. 2011, Persp. Plant Ecol. Evol. Syst. 13: 101–110 • 4 genetické skupiny, 1výrazně jiná (JV poddruh) • hranice skupin souhlasís programem Barriers • asi alopatricky se vyvíje-jící skupiny + pozdějšíkontakt a tok genů • souvislost s přežitím zalednění (2 poddruhy, v severním asi více refugií) • …ale populace z potenciálně refugiálních míst (stanovených podle jiných prací) nejsou geneticky bohatší, rozdíly možná později setřeny genovým tokem

40. Fylogeografie - cpSSR Quintela-Sabarís et al. 2011, Plant Biol. 13: 391-400 • Cistus ladanifer, 38 populací, testováno 10 úsekůcpSSR, z toho variabilní 2 • vnitropopulační diverzita, mezipo-pulační rozdíly (GST, RST), AMOVAhaplotypová síť,… • PCoA, Barriers, SAMOVA Spatial AMOVA (Dupanloup et al. 2002)se snaží rozdělit populace do K skupin, geograficky homogenních s min. vnitro- a max. meziskupinovou variabilitou • 6 + 3 alely → 11 haplotypů • 3 hlavní skupiny, 2 reliktní (H7, H8) a 1 široce rozšířená (H4, H5) • ancestrální asi H8, přišlo to z Maroka

41. Fylogeneze, vymezení taxonů • použití pro fylogenezi možné, ale se značným omezením (sice velká variabilta, ale i spousta nevýhod): • neznáme rozmístění lokusů v genomu, lokus je „bodová“ informace (méně informace než 1 sekvenovaný úsek!) → použít víc lokusů, ideálně fyzická mapa • problémy s homologií (fylogeneze potřebuje IBD, ne IIS) → pouze u blízkých druhů a na nižších úrovních • neznámá mutační dynamika, nelze použít mutační modely – z běžných metod konstrukce stromů zbývá pouze maximální parsimonie a distanční metody (např. neighbour-joining) • použití pro vymezení (kryptických) druhů / linií: Ramaiya et al. 2010, Am. J. Bot. 97: 1707–1718 • játrovka Frullania asagrayana, sekvenčně zcela uniformní, ale SSR ukazují na přítomnost 2 linií

42. Fylogeneze Kim et al. 2012, Plant Syst. Evol. 298: 811–817 • rod Schoenoplectiella (Cyperaceae), prob-lémy s vymezením druhů, asi hybridizace,ale rodiče hybrida nejasní • 6 SSR lokusů; polyploidi → prezence / absence alel • MP a NJ strom, STRUCTURE • 59 alel, některé druhově specifické • 2 hlavní příbuzenské skupiny • potvrzeny všechny druhy, vč. 1 morfolo-gicky slabě vymezeného (geneticky jasný) • předpokládaný hybrid není hybrid, ale slabědiferencované populace jednoho z druhů

43. Software • MSA (Microsatellite Analyzer) http://i122server.vu-wien.ac.at/MSA/MSA_download.html • MICROSAT http://hpgl.stanford.edu/projects/microsat/ • The Excel Microsatellite Toolkithttp://www.animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-toolkit/ kontrola dat, převod do formátů pro Arlequin, Microsat, Fstat,… • ATETRA http://www.vub.ac.be/APNA/ATetra.html odhad frekvencí alel a genotypů u tetraploidů • Cervus http://www.animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-toolkit/ frekvence alel, parentage analysis (kodominantní data, diploidi) • Genclone http://www.ccmar.ualg.pt/maree/software.php?soft=genclon identifikace multilokusových genotypů, výpočet Psex, kinship coefficient,…