1 / 11

Analýzy genové funkce, přehled využití reportétrových genů v přímé a reverzní genetice

Analýzy genové funkce, přehled využití reportétrových genů v přímé a reverzní genetice. Reportérové geny. kódují enzymy, jejichž aktivitu je možné vizualizovat či jsou vizualizovatelné přímo samy stanovení kvantitativní a/nebo kvalitativní

moanna
Download Presentation

Analýzy genové funkce, přehled využití reportétrových genů v přímé a reverzní genetice

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Analýzy genové funkce, přehled využití reportétrových genů v přímé a reverzní genetice

  2. Reportérové geny • kódují enzymy, jejichž aktivitu je možné vizualizovat či jsou vizualizovatelné přímo samy • stanovení kvantitativní a/nebo kvalitativní • použití pro analýzy aktivity promotorů a fúzních proteinů, optimalizace transformačního protokolu, … Problémy: • pozadí (autofluorescence, enzymová aktivita v pletivu) • stabilita proteinu (maskuje změny v aktivitě promotoru)

  3. Reportérové geny gen produkt substrát stanovení gusA b-glukuronidáza (E. coli) MUG fluorescence X-gluc histochemicky luc luciferáza (světluška) luciferin luminiscence gfp green fluorescent protein xxx fluorescence (medůza)

  4. GFP, DsRed, mCherry– fluorescentní proteiny • - unikátní nástroje pro vitální barvení buněk a buněčných struktur, • - fluorescenční značky kódované genem • původ z mořských láčkovců • původní geny modifikovány: • - fluorescenční vlastnosti, • - kódování, sestřih, stabilita, …. Aequoria victoria Barevné varianty GFP a DsRed

  5. GUS stanovení kvalitativní (X-gluc) • po inkubaci substrát štěpen na bezbarvý intermediát, jehož oxidací vzniká modrý nerozpustný precipitát • pozadí ve většině pletiv malé • produkt málo difunduje - akumuluje se v buňce, kde k expresi genu dochází • většina technik pro buňky letální (fixovaný materiál) stanovení kvantitativní (MUG) • extrakce GUS enzymu, fluorimetrické stanovení • velmi citlivá metoda, malé pozadí

  6. Analýzy genové funkce studium funkce vybraných proteinů (genů) • modulace exprese: • zvýšení množství proteinu – vnesení genu pod kontrolou silného (konstitutivního) promotoru • snížení množství proteinu RNAi (popř. nalezení inzerčních mutantů ve veřejně dostupných kolekcích) • Tilling – bodové mutace v komerčních kolekcích (viz dříve) • fúze promotoru či kódující sekvence genu s reportérovým genem

  7. Snížení množství proteinu navozením RNA interference (tvorby dsRNA): 1) gen v antisense orientaci (za promotor vložen opačně) 2) vnesení vlásenkového konstruktu (např. sense-intron-antisense) 3) vnesení genu bez terminátoru (dsRNA díky aktivitě RdRP) intermolekulární párování + intramolekulární párování RdRP syntéza komplement. vlákna k transkriptu - štěpení dsRNA DCL, tvorba siRNA, sekvenčně specifická degradace mRNA, popř. zastavení transkripce v důsledku cílené metylace DNA

  8. Analýza promotoru • fúze analyzovaného promotoru s reportérovým genem (transkripční fúze): • Určení • - tkáňové specifity (popř. síla promotoru) • - vývojové specifity • změnách exprese v závislosti na faktorech vnějšího (vnitřního) prostředí • Potřeba ověřit i jinými postupy - riziko artefaktů! reportérový gen PgenT Nelze měnit v genomu, vkládá se další (upravená) kopie genu (výměna za reportérový gen či přidání reportérového genu)

  9. Fúze promotoru s reportérovým genem pro GFP a GUS Arabidopsis thaliana

  10. Tvorba fúzního proteinu s GFP - zrušení stop kodónu studovaného genu a připojení GFP genu ve čtecí fázi (translační fúze) - domény, interakce (!)

  11. Tvorba fúzního proteinu s GFP - studium lokalizace proteinů, proteinových interakcí, - sledování různých pochodů v živé buňce – značení buněčných struktur … Golgiho komplex chromozómy mikrotubuly

More Related