Kursus 3: Toidu kvaliteet

1. Poola Teaduste Akadeemia B. Prusak Kursus 3: Toidu kvaliteet Teema 5: Seostatus ja läbipaistvus „köögist farmini”, riskid ja kvaliteedi tagamine Õppetund 1: Loomaliikide liha ja lihatoodete tuvastamine molekulaarsete meetoditega

2. Sisukord • Bioloogiliste liikide esindajad ja testitavad toidutooted • Identifitseerimisprotseduuride kasutamise valdkonnad • Identifitseerimismeetodite klassifikatsioon • Traditsioonilised meetodid • Standardprotseduuride puudused • Nõuded identifitseerimisprotseduuridele • Molekulaarsed identifitseerimisprotseduurid • Sihtmärgid mtDNA analüüsiks identifitseerimistestides • mtDNA iseärasused, mis on kasulikud identifitseerimis-meetodite korral • Tsütokroom b geen • Tuuma-DNA analüüsi sihtmärgid • Molekulaartestides kasutatav strateegia • Otsene järjestusanalüüs • Liigilise kuuluvuse kindlaksmääramine nukleotiidide järjestuse põhjal Täiendav materjal: WP3T5L1.pdf

3. 1.Bioloogiliste liikide esindajad ja testitavad toidutooted Liha – veis, siga, lammas, kits, kodulinnud, kala, ulukiliha jt Töödeldud liha – praetud, keedetud, konserveeritud, marineeritud, suitsetatud jt Eri loomaliikide lihast tehtud toiduproduktid Teised toiduproduktid – nt kalamari Liha võltsimine (kassi, koera, näriliste jt liha)

4. 2.Identifitseerimisprotseduuride kasutamise põhilised valdkonnad • Produktide õige märgistuse kontrollimine majanduslikel eesmärkidel • Produktide koostise ja kvaliteedi kontroll • Sanitaarsete riskide monitooring • Haruldastest ja kaitstud loomaliikidest valmistatud produktide monitooring turgudel • Salaküttimisel saadud ja illegaalse liha müügi kontroll

5. 3.Identifitseerimismeetodite klassifikatsioon Liha liigilise kuuluvuse määramise meetodid jagatakse peamistesse rühmadesse: • traditsioonilised meetodid, • molekulaarsed meetodid.

6. 4. Traditsioonilised meetodid • Liha liigilise kuuluvuse identifitseerimiseks kasutatakse standarduuringutes kolme peamist meetodit. • Valkude elektroforees • Immunoloogilised protseduurid • Kõrge lahutusvõimega vedelik-kromatograafia (HPLC)

7. 5.Standardprotseduuride põhilised puudused • Sugulasorganismide valkude ristreaktsioonide võimalus • Valkude ebastabiilsus töötlemisel ja keskkonnategurite toimel • Võimalik analüüsida ainult värsket või värskelt külmutatud proove • Võimalik kindlaks teha piiratud arv liike

8. 6.Nõuded identifitseerimisprotseduuridele • Võimalus eristada lähedasi sugulasliike • Bioloogiliste proovide stabiilsus keskkonna ja toidu töötlemise tingimustele • Identifitseerimistestide tundlikkus, usaldusväärsus, korduvteostatavus, spetsiifilisus • Ühe testiga võimalik eristada suur arv liike

9. 7.Molekulaarsed identifitseerimisprotseduurid Molekulaarsed identifitseerimisprotseduurid põhinevad tuuma või mitokondrite DNA spetsiifiliste regioonide analüüsil, mille nukleotiidide järjestus on iseloomulik kindlale loomaliigile.

10. 8.Sihtmärgid mtDNA analüüsiks identifitseerimistestides • Tsütokroom b geen • Kõrge muutlikkusega piirkonnad D-lingi järjestuses

11. 9.mtDNA iseärasused, mis on kasulikud identifitseerimismeetodite korral Mitokondri genoom – lihtne, rõngasmolekul, väike arv geene, emapoolselt päranduv, mitte rekombineeruv, kõrge mutatsiooni määr; sisaldab nii konservatiivset kui muutlikku osa; väga stabiilne koopiate arv igas rakus.

12. 10.Tsütokroom b geen Tsütokroom b geeni analüüsil põhinev loomaliikide tüpiseerimine ja identifitseerimine on hästi välja töötatud ja laialdaselt kasutusel. Tsütokroom b geen koosneb osadest, mis on väga konservatiivsed liikidel, ja osadest, mis on liigispetsiifilised. See võimaldab töötada välja meetodid, mis võimaldavad eristada ühe testiga palju liike.

13. 11.Tuuma-DNA analüüsi sihtmärgid • Satelliit DNA järjestus • DNA järjestused, mis on kindlakstehtavad spetsiifiliste hübridisatsiooni uuringutega

14. Otsene PCR Nested PCR DNA regiooni kloneerimine - PCR Testitavproov DNA eralda-mine Otsene järjestamine Multiplex PCR Lõikamine restriktsiooniensüü-midega Hübridiseerimine spetsiifiliste DNA proovidega Andmete analüüs Kodeerivad järjestused -PCR-i produktide eristamine, kus praimeri-paaris on üks liigispetsiifiline ja üks universaalpraimer Pikkuse polümorfism spetsiifilistes mikrosatelliidilookustes 12.Molekulaartestides kasutatav strateegia

15. 13.Otsene järjestamine Otsene järjestamine on molekulaarne meetod, mis võimaldab saada täielikku informatsiooni nukleotiidide järjestusest testitud genoomi piirkonnas. Igat nukleotiidi positsiooni analüüsitakse kui potentsiaalselt varieeruvat kohta. Protseduuri otsustav etapp on DNA lõigu valimine. Igat liiki tuleks kirjeldada unikaalsete nukleotiididega kindlas positsioonis. Seega analüüsitud fragmentide pikkus ja mutatsioonide määr on väga tähtsad identifitseerimistestide koostamisel.

16. 14.Liigilise kuuluvuse kindlakstegemine nukleotiidide järjestuse põhjal Analüüsitud liha- ja toiduproovide päritolu on võimalik määrata nukleotiidide järjestuse põhjal ainult võrdlemisel tuntud standardjärjestusega. Laboratoorium loob oma järjestuste andmebaasi või kasutab GenBank (või mõnda muud internetist kättesaadavat andmebaasi), mis sisaldab informatsiooni suurest arvust nukleotiidide järjestustest.