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聚合酶链反应. PCR ( P olymerase C hain R eaction). 一、实验目的 : 掌握 PCR 技术的基本原理和操作. 二、实验原理. PCR 的基本原理. 变性、复性、半保留复制. PCR 实验步骤. 变性 90 ～ 97℃. 退火 45 ～ 55℃. 延伸 72℃ 左右. PCR 引物设计. 一对引物，分别与 5 ′ 和 3′ 端互补 长度： 15 ～ 30 个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性. PCR 反应体系的五要素 ：
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聚合酶链反应 PCR (Polymerase Chain Reaction)
一、实验目的: 掌握PCR技术的基本原理和操作
二、实验原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 • PCR实验步骤 • 变性 90～97℃ • 退火 45～55℃ • 延伸 72℃左右
PCR引物设计 一对引物，分别与5 ′和3′端互补 长度：15～30个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性
PCR反应体系的五要素： • 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ • Taq DNA聚合酶 • 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus • 良好的耐热性 • Mg2+依赖性 • 无校读功能
三、实验过程 （一） 引物的设计： 5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’ 5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’ 引物的设计可以参照： 两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo软件
（二） 变性、复性、杂交 • 1.无菌eppendorf管中加 • 双/三蒸水 9 l • 10×缓冲液 2 l dNTP混合物 3 L引物 2 l 模板DNA 2 l 25mmol/L Mg2+ 2.5 l • 液体石蜡 10 l 混匀离心5sec， 94℃水浴，2min
2. + Taq DNA聚合酶 0.55 l 3.程序设置： 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 30s 35个循环 （一般在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒） 反应结束后加中止液10 l
（三）扩增结果：220-242 bp 对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃
四、注意事项 • PCR反应中可能出现的问题： • 假阴性，不出现扩增条带 • 假阳性 • 出现非特异扩增带
（一）防止污染 • 试剂小量分装 • 吸头及EP管一次性使用 • 器皿及工作区域要分开，无菌操作 • （二）设立对照： • 阳性对照： 阳性模板 • 阴性对照： 阴性模板 • 试剂对照： 除模板外的所有组分
五、PCR的反应特点 • 特异性强 • 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10- 12级的起始待测模板扩增到微克(g= 10 -6)水平 • 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应 • 对标本的纯度要求低： • DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测
PCR Process Process 变性 退火 延伸 1 cycle 2 cycle 3 cycle
