Réunion Biomarqueurs Grand Est Strasbourg, 3 et 4 mai 2013 Dr Etienne Rouleau

1. Evaluation Externe de la Qualité pour améliorer le Diagnostic Moléculaire des Tumeurs SolidesCancer du poumon et du côlon  Réunion Biomarqueurs Grand Est Strasbourg, 3 et 4 mai 2013 Dr Etienne Rouleau Institut Curie, Paris - France http://www.fotocommunity.de/pc/pc/cat/9479/display/30415918

2. Critères de performances

3. Critères de performanceRéponse clinique • Objectif : identification des tumeurs sensibles au traitement • Identification des cancers colorectaux KRAS sauvages • Identification des cancers du poumon EGFR mutés Taux de réponse Taux de réponse               Anti-EGFR : 43% [28-57]    DIAG                  Anti-EGFR : 10% Anti-EGFR : <2%   F Di Fiore et al British Journal of Cancer (2010) 103, 1765–1772.

4. Critères de performanceRéponse clinique 45 publications Se 0.49 (CI, 0.43 to 0.55) Sp 0.93 (CI, 0.87 to 0.97). Dahabreh et al Ann Intern Med. 2011;154:37-49.

5. Critères de performanceUn unique test ?

6. Critères de performance Linardou H et al The Lancet Oncology 9,2008 : 962-972 Ex2 bi-ds : 34,4% (87/253) Se 0,47 [0,35-0,60] Sp 0,87 [0,62-0,96] AD : 37,6% (225/598) Se 0,48 [0,42-0,54] Sp 0,99 [0,89-1,00]

7. Critères de performanceHétérogénéité des méthodes (1) Taqman (2) HRM (3) Pyroséquençage (4) SNAP Shot (5) Séquençage direct (2) Spathis A et al. Anticancer Res. 2010 Jun;30(6):1969-75. (1) (5) (4) (3) Di Fiore F et al. British Journal of Cancer (2007) 96, 1166 – 1169

8. Critères de performanceHétérogénéité des méthodes Nomber of patients KRAS+ KRASwt NC 1913 37% 63% 5% Sanger Sequencing HRM/sequencing 3748 35% 65% 6% Pyrosequencing 2457 37% 63% 4% Allele specific (Taqman…) 5133 40% 60% 3% Snap Shot 1926 42% 58% 10% Other methods 1123 38% 62% 3% Total 16 300 38% 62% 5% Data 2009 INCA – on declaration - 946 patients without any technique information KRAS+ : muted KRAS, KRASwt : wild-type KRAS, NC : non contributive

9. Critères de performanceHétérogénéité des méthodes– KRAS B) A) C) Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses KRAS, B) Sensibilité globaledéclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse. 5 participants utilisent au moins un kit commercial Therascreen KRAS Pyro (Qiagen - CE-IVD) / COBAS KRAS Autres sociétés impliquées : 11 Life Tech, 6 Qiagen, 3 Roche

10. Critères de performanceMéthodes maisons – KRAS -11-94 111+48 Tableau : Distribution des amplicons en fonction des amorces déclarées dans le cadre du STIC MOKAECM. En majuscule, région avec une forte homologie sur la partie codante du gène KRAS.

11. Critères de performanceHétérogénéité des méthodes– KRAS Tableau : Evolution des techniques utilisées pour le génotypage KRAS en France entre le STIC MOKAECM en 2009 et l’EEQ 2012.

12. Critères de performanceHétérogénéité des méthodes – EGFR exon 21 A) B) C) Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses EGFR exon 21, B) Sensibilité globale déclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse.

13. Critères de performance Plusieurs laboratoires = une technique un protocole Plusieurs laboratoires = plusieurs techniques plusieurs protocoles Un laboratoire = une technique un protocole

14. GGT GGC 34 35 38 Critères de performance • Quelle est la performance réelle des analyses moléculaires KRAS and EGFR au niveau national ? • Plusieurs facteurs : techniques (AS/DS), protocoles / SOP, organisation du laboratoire • Critère principal : Réponse au traitement • Critères indirectes • Statistique des mutations • Sans biais de sélection : ERBB2, KRAS • Avec un biais de sélection : EGFR • Validation de méthode : limite de détection • Contrôles internes de qualité • Contrôles externes de qualité (DS) (AS)

15. Programme KRAS & EGFR EQA

16. OrganisationContexte • Bonne pratique de laboratoire • Preuve de la compétence • Accréditation des laboratoires • Nombreux tests « maisons » • Suite de MOKAECM / ERMETIC • Ne pas confondre EEQ et CQI • EEQ et leurs recommandations • Recommandation ESP • ISO17043

17. Joint partners Partner Platforms Reference Platforms OrganisationProgramme participatif Nijmegen Leuven AFAQAP Curie

18. OrganisationProgramme participatif • Plateformes partenaires EGFR • Ile de France Ouest - Hôpital de FOCH (Dr DENOUX – Plateforme HUVEGEN), • Centre Hospitalier Universitaire de Nancy (Pr VIGNAUD), • Paris - Hôpitaux Paul Brousse-Bicêtre-Antoine Béclère (Pr LEMOINE), • Lille – Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH), • Clermont – Centre Jean Perrin (Pr PENAULT-LLORCA), • Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET), • Marseille – Assistance-Publique des Hôpitaux de Marseilles (Pr OUAFIK) KRAS • Bordeaux - Institut Bergonier (Pr SOUBEYRAN), • Centre Hospitalier Universitaire de Nice (Dr PEDEUTOUR), • Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET-Dr LE MARECHAL), • Paris - Hôpital Ambroise Paré (Pr EMILE), • Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH), • Centre Hospitalier Universitaire de Rouen (Pr SABOURIN), Lyon - Centre Léon Bérard (Dr WANG) • Plateforme de référence : Nijmegen laboratory (H van Krieken, M M.Ligtenberg)

19. Expert moléculaire Expert pathologique Expert qualité ANONYMISATION ANONYMISATION

21. OrganisationPourquoi 10 échantillons ?

23. OrganisationMatériel de référence ADN Extrait ADNPlasmides Bloc artificiel Contrôle de tout le processus Tout Partiel Partiel Tout / partiel = spécimen biologique Identique Partiel Non Proche Prêt à l’emploi Lames Oui Oui Lames Reproductible A valider A valider Oui Oui / à valider Quantité disponible Limitée Limitée Illimitée Illimité Stabilité dans le temps Limitée Limitée Oui Oui Eventail de situation Limité Limité Important Important Consentement / éthique Oui Oui Non Non CIQ Calibrateur CEQ

24. OrganisationPérimètre et objectifs HES Analyse histologique Sélection du matériel Enrichissement ADN Bloc Analyse moléculaire 3 lames 6µ Choix technologique Process analytique

25. OrganisationParticipants • Participation nationale • 45 EGFR / 50 KRAS participants • EGFR : 4 • KRAS : 9 • EGFR & KRAS : 41 • 450 EGFR et 500 KRAS cas (3 lames)

26. Résultats GENOTYPE

27. GénotypeBilan des erreurs • 9 erreurs concernant 8 participants • KRAS • 4 erreurs • 3 participants avec au moins 1 erreur (6%/50) • 0 participant avec une erreur de génotype grave • EGFR • 5 erreurs • 5 participants avec au moins 1 erreur (11%/45) • 4 participants avec une erreur de génotype grave

28. GénotypeBilan des erreurs • 4 erreurs avec des conséquences thérapeutiques • Un faux positif (1 EGFR « activating mutation ») : -2 points • Deux faux négatifs (2 EGFR) : -2 points • Un échec d’amplification (1 EGFR exon 21 mutation) : -2 points • 5 erreurs sans conséquence thérapeutique • Erreurs de mutation (2 KRAS – 1 EGFR) : -2 points • Un échec pour un KRAS muté (1 KRAS muté) : -2 points • Une erreur d’échantillon sur le rapport (1 KRAS muté ) : -1 point

29. GénotypeSensibilité et spécificité nationale KRAS Sensibilité : 100% Spécificité : 100% 0% erreurs avec un impact thérapeutique EGFR Sensibilité : 98,7% Spécificité: 99,6% 0,89% erreurs avec un impact thérapeutique Tables : Résultats globaux des EEQ KRAS et EGFR.

30. GénotypeDonnées de la littérature • UK NEQAS EGFR • Deans ZC, et al. J Clin Pathol 2013;66:319–325. • 3 rounds 2010-2011: Erreurs : 24% - 6,7% - 6,4% • 49 participants dernier round • UK NEQAS GIST KIT/PDGFRA • Wong et al. J Clin Pathol 2012;65:786–790. • 13%, 33%, 19% et 4% (2008-2011) • 8 à 16 participants

31. GénotypeExactitude du génotype • Description de la délétion • EGFR : délétion sans description (7 cases) • EGFR : erreurs de génotype (13 cases) • Echantillon EGFR : B200 • Mutation : c.2239_2248delinsC, p.Leu747_Ala750delinsPro • c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del • c.2238_2249delinsP, p.Leu747_Ala750delinsPro • c.2239_2247del ; p.Leu747_Glu749del • c.2236_2248delinsGAAC, p.Leu747_Ala750delinsPro • Echantillon EGFR : B484 • Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del • c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del • Echantillon EGFR : B009 • Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del • c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del

32. NC Nombre de participants Percentage of neoplastic cells B110 EGFR (NC : test failure) Génotype Sur-interprétation ? Echantillon EGFR B110 • Non exclusion • 4/23 soit 17% d’échec • Interprétation : échec ou sauvage • Laboratoire de référence : échec • Curie / Partenaire : sauvage

33. GénotypeSur-interprétation ? Importance d’avoir des seuils d’interprétation 

34. Résultats DELAI DE RENDU

35. Délai de réponseApproche analytique • Le délai de réponse de chaque participant sera évalué entre l’arrivée des échantillons au laboratoire et la validation du rendu des résultats sur le site internet: celui-ci étant idéalement de 10 jours (en référence aux nécessités cliniques), l’analyse comparera le résultat du laboratoire par rapport à l’ensemble des laboratoires français. • Délai : réception du colis – soumission sur le site • EGFR - moyenne 16,6 jours • KRAS - Moyenne 14,6 jours

36. Délai de réponseProgramme KRAS 32/50 Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ KRAS (classe 5).

37. Délai de réponseProgramme EGFR 27/45 Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ EGFR (classe 5).

38. Délai de réponseCorrélation KRAS et EGFR Délai EGFR Figure : comparaison des délais de rendu pour les participants aux deux programmes EGFR et KRAS

39. Résultats COMPTE-RENDU

40. Comptes-rendusApproche analytique • Les comptes rendus fournis par les participants sont analysés systématiquement en vue de formuler des recommandations d’amélioration ; l’évaluation portera sur l’interprétation, les données saisies et la présence de plusieurs items selon les recommandations de l’INCa • Grille des contrôles EQA Européens • Anonymisation de tous les comptes-rendus • Double lecture de tous les rapports

41. Comptes-rendusInterprétation % des réponses correctes Figure : Score des items correspondants à l’interprétation (évaluation sur trois dossiers).

42. Comptes-rendusInterprétation % des réponses correctes Figure : Score des items correspondants à l’interprétation (évaluation sur trois dossiers).

43. Comptes-rendusScore EQA ESP (/4.5)

44. Comptes-rendusScore EQA ESP - KRAS (/4.5) 12/50 Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ KRAS.

45. Comptes-rendusScore EQA ESP - EGFR (/4.5) 9/45 Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ EGFR.

46. Comptes-rendusPoints à améliorer Moins de 50% de participants avec l’item • Sous numéro d'échantillon : numéro de coupe • Nombre de lames : 3 • Raison de la prescription : « mise sous traitement » • Limite de détection de la technique • Pagination • Date de prélèvement • NM séquence de référence

47. Cellularité

48. Estimation de la cellularitéCellularité KRAS Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2013 (ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)

49. Estimation de la cellularitéCellularité EGFR Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2012 (ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)

50. Estimation de la cellularité