Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal.

1. Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. • Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal. • Formas de actuación mediante terapia génica. • Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular. • Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.

2. ¿QUÉ es la Terapia génica? “Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo para producir un efecto terapéutico.” DNA como medicamento o Curar con genes

3. ¿QUÉ es Gene Marking? “Proceso que utiliza técnicas comunes a la Terapia Génica pero sin buscar un efecto terapéutico.” Ej. Seguir la pista a determinadas células en el organismo.

4. “Añadir función” Terapia Génica “Suprimir función”

5. “Añadir función” Terapia Génica

6. Añadir función • Sustitución del gen deseado. • Reparación de una mutación. • Añadir un gen

7. Añadir función • Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual) • Introducción del transgen al azar (añadir un gen)

8. Terapia Génica “Suprimir función”

9. Suprimir función • Muerte celular (suicidio de las células) • Oligonucleótidos antisentido (expresión). • Ribozimas (Ruptura).

11. OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO iRNA: RNA de interferencia

12. MODOS DE INTRODUCCIÓN

13. “In vivo” Terapia Génica “Ex vivo”

14. IN VIVO/EX VIVO DIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES EX VIVO SOLO EN CULTIVOS CELULARES

15. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS EX VIVO

16. DNA desnudo • Inyección de la molécula de DNA. • Músculo , Piel, Mucosas y Timo. • Introducción por “nuclear pore complex”. • Talla ILIMITADA. • Bajo porcentaje de transfección • No hay integración en el genoma. • No hay amplificación del DNA.

17. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS • INDIRECTOS - Mediados por vectores EX VIVO

18. ¿Qué es un vector? • “Son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen exógeno a la célula, facilitando la entrega, biodisponibilidad intracelular del mismo de modo que pueda funcionar correctamente”

19. Características del vector ideal • Especificidad de órgano o tejido. • Protección del DNA. • Elevada disponibilidad. • Expresión eficaz. • No inmunógeno/sin repuestas inflamatorias. • Seguro paciente/entorno.

20. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos • INDIRECTOS EX VIVO

21. Una cadena de RNA. Protegidos por una cápside. Talla de 80 a 130 nm. Tres genes importantes: gag: proteínas de la cápside pol: transcriptasa inversa e integrasa Env: proteínas de envoltura y reconocimiento de receptor Zonas LTR: Long Terminal Repeat VECTORES RETROVIRALES

22. LTR----GAG/POL--ENV----LTR LTR----PROMO+GEN----LTR Construcción Retroviral MMLV: Moloney Murine Leukemia Virus

23. CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free) RNA LTR---GEN---LTR Producción de vectores retrovirales -------GAG/POL--ENV-------

24. Retrovirus Recombinantes Producción de vectores retrovirales CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free)

25. Alta eficacia de transducción. Tamaño del inserto 8Kb. Alta expresión una vez introducido en el genoma. Sistema muy bien estudiado. Proteínas del vector no se expresan en el huésped. Necesita células en división. Se consiguen títulos muy bajos de virus. Integración al azar en el genoma. Transducción “in vivo” poco efectiva. Características de los vectores retrovirales

26. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos • INDIRECTOS EX VIVO

27. DNA lineal de cadena doble. Más complejos que los retrovirus. Tres genes importantes: E1: rescata células de la quiescencia. E2: proteínas relacionadas con la replicación del DNA. E3: defensa ante el sistema inmunitario. E4: regulación de la transcripción. VECTORES ADENOVIRALES VIRUS RECOMBINANTES E1 Y E3 ELIMINADOS

29. Eficaces a la hora de transferir el gen episomal a una gran cantidad de células. Fácil producción en el laboratorio. Gran respuesta inmunitaria. Dificultad para repetir la inyección de virus. Características de los vectores adenovirales

30. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos • INDIRECTOS EX VIVO

31. DNA lineal de cadena doble. Se insertan en el genoma. Dos genes : rep: replicación e integración del virus. cap: tres proteínas estructurales víricas. TR: repeticiones terminales-145 nucleótidos. VECT. ADENOASOCIADOS VIRUS RECOMBINANTES SOLO CONTIENEN TR Células que poseen los genes rep y cap.

32. Expresión a largo plazo. No hay respuesta inmunitaria. Talla limitada del gen a introducir (aprox 5 Kb). Dificultad para obtener grandes cantidades. Características de los vectores adeno-asociados

33. http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htmhttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

34. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos • INDIRECTOS EX VIVO

35. LIPOSOMAS • CATIÓNICOS • Su carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo. • pH SENSIBLE O ANIÓNICO • Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”. POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES ESPECÍFICOS

36. Protegen al DNA No hay limite de tamaño Enviar a lugares específicos. Baja eficacia Expresión transitoria. Toxicidad celular Inhibición por componentes séricos. Características de los liposomas

37. IN VIVO/EX VIVO DNA desnudo • DIRECTOS - Retrovirus -Adenovirus - Adenovirus asociados - Liposomas - Fragmentos específicos • INDIRECTOS EX VIVO Precipitación con fosfato de calcio • QUIMICOS Electroporación • FISICOS

38. MÉTODOS “EX VIVO” (Cultivos celulares) Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el enfermo

39. MECANISMO “EX VIVO”

40. MODO DE INTRODUCCIÓN

41. Algunas... • Enfermedades monogénicas. • Cancer. • Enfermedades infecciosas o parasitarias. • Enfermedades neurodegenerativas

42. Enfermedades Monogénicas - Conocidas por la mayoría como las únicas candidatas para el tratamiento. - Aporte de la proteína/enzima deficitaria. - Posibilidad de realizar terapia génica germinal..

43. Algunas... Deficiencia Inmune Severa Combinada Deficiencia Inmune Severa Combinada ligada al cromosoma X Fibrosis Quística Enfermedades lisosomales (Gaucher, etc.)

44. Deficiencia Inmune Severa Combinada - Deficiencia en la enzima Adenosin Desaminasa. - 1/100.000 (25% de mortalidad). - Fragilidad de los linfocitos T.. INMUNOSUPRESION

45. David "niño burbuja", (Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)

46. Tratamientos - Aportación de la enzima recombinante: ADA PEG-ADA - Transplante de médula osea.

47. 1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa Combinada - 1990. Dr Blaese (EEUU) Dr. Bordignon (Italia) -1995 Demuestran la eficacia del tratamiento

48. Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad. (Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).

50. X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada -Mutación en el Cromosoma X - Deficiencia en la cadena g del receptor para la interleukina IL2RG - Hospital Necker de Paris (11 niños)