Eiwitonderzoek bij ziekten

1. Eiwitonderzoek bij ziekten Jolein Gloerich

2. VWO Bernardinuscollege Heerlen Natuur & Techniek profiel

3. ScheikundeUniversiteit Utrecht Waarom? • Uitdagende studie • Chemische processen in het lichaam Afstudeerrichting Biochemie

4. Universiteit van AmsterdamAcademisch Medisch Centrum • Promotie onderzoek • 4 jaar • Laboratorium Erfelijke Stofwisselingziekten • Eiwitonderzoek

5. Radboud Universiteit NijmegenUniversitair Medisch Centrum • Wetenschappelijk onderzoek • Laboratorium Kindergeneeskunde & Neurologie • Erfelijke stofwisselingsziekten • Nijmegen Proteomics Facility

6. Overzicht • Inleiding • Eiwitten en ziekte • Kijken naar alle eiwitten • 2 technieken om eiwitten te scheiden • Identificatie van eiwitten • Massaspectrometer • Wat hebben we hieraan???

7. Inleiding Eiwitten A B Onderzoek naar ziektes: eiwitten!!!

8. Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

9. Inleiding DNA RNA Eiwit Eiwitsynthese

10. Inleiding DNA RNA Eiwit Eiwitsynthese

11. Inleiding Eiwitten • Aminozuren • Verschillendeeigenschappen • Basisch/zuur • Hydrofiel/hydrofoob • Lading

12. Inleiding Eiwitten • Aminozuren • Verschillende eigenschappen • Volgorde aminozuren • Aantal aminozuren/massa

13. Inleiding Erfelijkeziekte

14. Inleiding Fout in DNA: • Eiwit met fout aminozuur: • Geen invloed op functie • Eiwit werkt niet meer • Geen eiwit aanwezig

15. Inleiding Erfelijke ziekte A B

16. Inleiding A A A B A A Erfelijke ziekte

17. Inleiding A A B C A A

18. Inleiding A A B C A A Regulatie

19. Inleiding • Alle eiwitten in een weefsel → proteoom • Kijken naar alle eiwitten → proteomics Hoeveel eiwitten zijn er ???? In totaal: ± 2.000.000 eiwitten In een weefsel: ± 4.000-5.000

20. Inleiding • Cel: alle genen aanwezig, maar niet alle eiwitten! Soorten eiwitten afhankelijk van functie:

23. Inleiding Onderzoek naar ziekte Gezonde persoon Patiënt

24. Inleiding Onderzoek naar ziekte Kijken naar verschillen in eiwitten: • Aanwezig/afwezig • Verschil in concentratie

25. Inleiding • Probleem: • 4000 verschillende eiwitten in weefsel • Hoe kunnen we afzonderlijke eiwitten bekijken? • Scheiden van elkaar

26. Scheiding van eiwitten op lading • De lading van een aminozuur in oplossing is afhankelijk van de pH Het iso-elektrisch puntis de pH waarbij de netto lading van een aminozuur 0 is, dus evenveel postieve als negatieve ladingen

27. Scheiding van eiwitten op lading • Een eiwit heeft ook een iso-elektrisch punt, dus een pH waarbij de netto lading 0 is. pH=9 pH=3 pH=7 - - - + + + + - - - + + + - + +3 Lading: 0 -2

28. Scheiding van eiwitten op lading Netto lading Iso-elektrisck punt 3 2 1 0 pH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 -1 -2 -3

29. Scheiding van eiwitten op lading Iso-Elektrische Focusing (IEF) pH 3 4 5 6 7 8 9 Mengsel van eiwitten Elektrisch veld aanbrengen + - Scheiding op lading gelukt !!!

30. Scheiding van eiwitten op massa zeef Gel van polyacrylamide Deze scheiding duurt heel lang….

31. Scheiding van eiwitten op massa …. Hoe kunnen we het sneller maken? Alle eiwitten een negatieve lading geven met SDS…. …. een elektrisch veld ‘trekt’ (negatieve) eiwitten sneller door de gel Gel-elektroforese

32. Scheiding van eiwitten op massa Gel-electroforese - Moleculair gewicht (Mw) +

33. Scheiding van eiwitten op massa Gel-electroforese - Moleculair gewicht (Mw) +

34. Scheiding van eiwitten op massa Gel-electroforese 110 95 75 60 Moleculair gewicht (Mw) 45 35 20 15

35. Scheiding van eiwitten Lading EN massa Iso elektrisch punt 3 4 5 6 7 8 9 IEF + -

36. Scheiding van eiwitten Lading EN massa Iso elektrisch punt 3 4 5 6 7 8 9 IEF + - SDS gel-elektroforese Moleculair gewicht

37. Scheiding van eiwitten Lading EN massa Iso elektrisch punt 3 4 5 6 7 8 9 IEF + - SDS gel-elektroforese Moleculair gewicht

38. Scheiding van eiwitten2-D (lading en massa) Na kleuring van eiwitten: Kaart van bijna alle eiwitten in een weefsel veel eiwit weinig eiwit felle stip vage stip

39. Vergelijking gezond-ziek • 2-D scheiding van eiwitten uit weefsel van patient en controle • Nooit helemaal hetzelfde…

40. Vergelijking gezond-ziek … daarom: tegelijkertijd patient en controle bekijken • Mixen van eiwitten patient en controle • Alles op één hoop • Geenverschilmeer te zien +

41. Vergelijking gezond-ziek Patient eiwitten Controle eiwitten • Alleeiwittenkrijgeneenkleurlabel • Patient: ROOD • Gezond: GROEN Label alle eiwitten ROOD fluorescent Label alle eiwitten GROEN fluorescent Mix

42. Vergelijking gezond-ziek • Groene en rode eiwitten mixen en in 1x scheiden met 2-D scheiding =ROOD =GROEN veel eiwit weinig eiwit felle stip vage stip

43. Vergelijking gezond-ziek • Mix van groen en rood: • [eiwit]=[eiwit]: gele stip • [eiwit]>[eiwit]: groene stip • [eiwit]<[eiwit]: rode stip =ROOD =GROEN

44. Vergelijking gezond-ziek • Vooral groene en rode stippen zijn verschillend in patient en controle • Welke eiwitten zijn dit?? =ROOD =GROEN

45. Identificatie van interessante eiwitten • Stipje uit de gel snijden: • Elke stip is 1 eiwit • Maar welk eiwit is dit?? =ROOD =GROEN

46. IEF Gel elektroforese Eiwit Uit gel snijden Interessant eiwit Vergelijking gezond-ziekEiwit isoleren `` Eiwit zit nog in gel Voor identificatie: eiwit uit gel halen Hoe??

47. Eiwit identificatie Trypsine: enzym betrokken bij eiwitafbraak. Knipt na elke Arg en Lys Digestie met trypsine Peptiden Uit gel door diffusie Eiwit in gel

48. Eiwit identificatieMassaspectrometrie Combinatie van peptiden Uniek voor een eiwit Ook de combinatie van massa’s is uniek voor dit eiwit! Massa’s kun je meten met een massaspectrometer

49. Gel Database Protein ? 1 2 3 tryptic stored data or “theoretical” peptides digestion mass spectrometry compare: “?” is identical to “2” Identificatie van een eiwit

50. Massaspectrometrievan peptiden Massaspectrometer: Weegschaal voor ionen Massa/lading (m/z) Dus: peptiden ioniseren!!!