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Aislamiento de plásmidos

Aislamiento de plásmidos. F ACULTAD DE Q UÍMICA, UNAM B IOQUÍMICA E XPERIMENTAL E QUIPO 2 D ÍAZ DE L EÓN S ÁNCHEZ P AMELA L ÓPEZ O RDUÑA E RIK L UNA T ORRES K EVIN M ARTÍNEZ L ÓPEZ G USTAVO.

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Aislamiento de plásmidos

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  1. Aislamiento de plásmidos FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL EQUIPO2 DÍAZ DE LEÓN SÁNCHEZ PAMELA LÓPEZ ORDUÑA ERIK LUNA TORRES KEVIN MARTÍNEZ LÓPEZ GUSTAVO

  2. Un plásmido es una molécula de ADN circular, extracromosómico, bicatenario, superenrrollado, que se replica de forma independiente del genoma y que puede ser propagado en una población.

  3. Características de los plásmidos • Son pequeños 5,000 -40,000 pb. • Replicación independiente y rastreabilidad. • Tienen un único origen de replicación. • Suelen llevar sólo uno o pocos genes. • Molécula de DNA circular. • Pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo posee. • Son transmisibles. Resistencia a antibióticos.

  4. Técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos Permiten obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular. La mayoría toma en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, y el tamaño de ambos.

  5. Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). • Puentes de hidrógeno de cadenas complementarias de DNA se rompen y las cadenas permanecen cercanas entre sí. • Cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. • Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas macromoléculas.

  6. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas. • Las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. • El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.

  7. Aislamiento de Plásmidos Se han desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos: • Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo • Recogida y lisis de las bacterias • Purificación del DNA plasmídico

  8. Objetivos • Realizar el aislamiento de DNA plasmídico. • Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación de DNA genómico.

  9. Reactivos • 5mL de medio Luria-Kanamicina (30μg/mL) • Solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris/HCl pH=8.0 y EDTA 10mM pH=8.0 • Solución de lisis: 0.2N NaOH y 1% SDS p/v • 3M Acetato de potasio pH=4.8 • 70% Etanol, Isopropanol • 10 N NaOH • 10% SDS

  10. Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior.

  11. Lisis celular con SDS/ NaOH 1.- Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Disuelve la membrana Se une a las proteínas y las desnaturaliza 2.- NaOH Desnaturaliza DNA (rompe los puentes de hidrógeno entre ambas cadenas)

  12. DodecilSulfato de Sodio (SDS) DodecilSulfato de Potasio (PDS)‏ (H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)‏ Neutralización 2.- Acetato de potasio/ ácido acético Neutraliza el NaOH (renaturalización de DNA plasmídico, se restablecen los puentes de hidrógeno). B) Convierte al SDS soluble a la forma insoluble PSD

  13. DNAplásmidico separado de los contaminantes por centrifugación      El sobrenadante contiene:         - El DNA del plásmido         - Los componentes celulares solubles      Pellet contiene:         - PDS         - Lípidos         - proteínas         - El DNA cromosómico

  14. Referencias • Sánchez Nieto, Sobeida. Manual de Prácticas de Bioquímica Experimental. Facultad de Química, Departamento de Bioquímica Básica. Semestre 2012-2 • Mendoza DF Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular: Su Aplicación en Genética Básica. Editorial de Universidad del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62 • Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2007. Molecular Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU

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