实验 1: 免疫沉淀凝集技术

1. 实验1: 免疫沉淀凝集技术

2. 絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 免疫浊度测定 沉淀反应 单向扩散试验 凝胶内沉淀试验 双向扩散试验 抗原-抗体反应 直接凝集反应 间接血凝试验 凝集反应 间接凝集反应 胶乳凝集试验 明胶凝集试验 背景

3. 免疫扩散技术——IgG测定

4. 实验原理 单向免疫扩散试验（single immunodiffusion test） • 将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内 • 制板、打孔、在凝胶孔中加入标准抗原溶液或待测样本。 • 抗原在凝胶中向四周呈辐射状扩散并与凝胶中的抗体发生特异性结合反应，在抗原抗体比例合适处形成白色沉淀环。 • 沉淀环的大小与抗原的浓度成正比。以不同浓度标准抗原液制成标准曲线，通过沉淀环大小（直径）可在标准曲线上查出待测标本中相应抗原的浓度。

5. 试剂与器材 • 羊抗人IgG血清（单扩效价1:100） • IgG标准液（10g/L） • 待测血清（1-4号标本） • 琼脂糖 • 生理盐水 • 温度计、玻璃板、打孔器、加样器、刻度尺、半对数纸等

6. 操作方法 • 琼脂凝胶准备 • 倒板、打孔 • 加样 • 扩散 • 结果判读

7. 琼脂凝胶准备 用生理盐水配制浓度为1.5%（15g/L）的琼脂凝胶，置水浴中煮沸溶化至澄清。（已完成）

8. 倒 板 • 将U型片置于两块玻璃板之间并以铁夹固定，直立于水平台面待用。 • 取10mL已溶化的琼脂糖凝胶于试管中 • 待琼脂糖温度降至56℃时，加入羊抗人IgG诊断学清100μL，在两支试管间颠倒混匀后迅速倒入事先固定好的玻璃板的间隙中。 • 待凝胶板完全冷却后，先取下铁夹再小心取下上面的玻璃板和U型片。

9. 打 孔 • 使用打孔器在凝胶板上打孔： 孔径：约3.5mm 孔距：10-12mm 6-7孔

10. 加 样 • 系列标准品稀释：用生理盐水将IgG标准品（S1）按1:2、1:4、1:8、1:16稀释成为系列标准品S2-S5。 • 待测样本用生理盐水1:2稀释。 • 每孔10μL，将标准品或稀释后样本加入孔中。 • 做好标记。

11. 扩 散 • 将加样完毕的凝胶板放入湿盒 • 37 ℃，扩散24小时

12. 结果判读 • 准确测量S1 -S5沉淀环的直径（单位：mm） • 以沉淀环直径与相应标准品浓度在半对数纸上绘制标准曲线。 • 准确测量待测样品的沉淀环的直径，在标准曲线上查出待测样本中IgG的浓度。

13. 注意事项 倒板： 1. 严格控制加入诊断血清时的温度：56 ℃ 温度过高：抗体的免疫活性受损，失去与相应抗原特异性结合的能力； 温度过低：凝胶开始凝结，抗体不能均匀分布于凝胶同时倒板也不平整均匀。 2. 应注意防止凝胶于下层玻璃板分离。取上层玻璃板时，应用手固定U型片并推动上层玻璃板，然后取下上层玻璃板。

14. 注意事项 打孔： 1. 孔的边缘光滑圆整，边缘不要破裂，底部勿与玻璃片脱离。 2. 孔径不宜过大，孔间距10-12mm，孔中心与凝胶板边缘的距离至少应有10-12mm。

15. 注意事项 扩散： • 在湿盒中进行。 • 扩散时琼脂板应保持水平，以免沉淀环变形，影响结果判定。 • 若沉淀环不清晰，可用1%鞣酸浸泡10min后再测量。

16. 测量： • 测量沉淀环必须准确，否则会明显影响结果。 • 当沉淀环不是正圆形时，应量取最大直径和最小直径后取二者的平均值带入计算。 • 每批实验均应同步绘制标准曲线。 • 样品最好做复孔，取直径的平均值带入计算。

17. 标准曲线绘制 抗原含量与沉淀环直径关系有两种换算关系： • Mancini曲线：适用于大分子抗原和长时间扩散处理（>48h）的结果处理。 C=K·d2 • Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果处理。 logC=K·d C：抗原浓度（mg/dL），d：沉淀环直径（mm），K：常数

18. 如何绘制标准曲线？ • 以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应孔IgG浓度为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。 • 注意：IgG浓度的单位为mg/dL； 沉淀环直径的单位为mm。

19. 方法评价 • 该方法稳定、简便、不需要特殊设备，一般实验室即可开展此项试验；其结果经染色、干燥后可长期保存。 • 但是，该方法灵敏度较低，观察结果需时间较长，每次测定需同时做标准曲线。

20. 胶乳凝集试验——RF测定

21. 实验原理 以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验： 聚苯乙烯颗粒具有很强的吸附蛋白质的能力，借此将抗原或抗体与胶乳颗粒结合成致敏颗粒，直接与待测标本中的抗体或抗原发生凝集反应。

22. RF为抗变性IgG的抗体，因此本实验使用的是人IgG致敏的聚苯乙烯颗粒。RF为抗变性IgG的抗体，因此本实验使用的是人IgG致敏的聚苯乙烯颗粒。

23. 试剂和器材 • RF检测试剂（商品化试剂） • RF阴性血清和阳性血清（试剂盒自带） • 黑色反应板、滴管、搅拌棒等

24. 操作方法 • 在黑色反应板上取3格，用滴管分别加待测血清、阳性血清和阴性血清各1滴，然后每格加入1滴致敏胶乳颗粒试剂。 • 用搅拌棒充分混匀后，连续摇动2~3min后与对照比较，观察结果。

25. 结果判断 • 胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性， 胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴性； • 首先观察阳性血清和阴性血清的反应结果，若前者为阳性反应后者为阴性反应，说明试剂有效； • 然后再观察待测样品的反应情况，并判断阴阳性。

26. 方法学评价 • 该试验方法简单、快速、特异性强、结果清晰易观察判断。 • 观察时应注意排除非特异性凝集反应。 • 如何进行半定量分析？

27. CIC测定

28. 实验原理： PEG沉淀法 聚乙二醇（PEG），分子量6000，具有较强的脱水作用，可引起蛋白质沉淀，沉淀具有选择性且对蛋白质生物活性无影响。是免疫浊度测定技术中常用的增浊剂。

29. PEG沉淀蛋白质的选择性与其浓度相关：2%PEG只能沉淀大分子，PEG沉淀蛋白质的选择性与其浓度相关：2%PEG只能沉淀大分子， 4%PEG能沉淀较小分子的循环免疫复合物 大于5%PEG，选择性沉淀特性消失。 在PH、离子强度等条件固定时，蛋白质分子量越大，用以沉淀的PEG浓度越小。

30. 分离血清免疫复合物一般采用最终浓度为3%~4%PEG。分离血清免疫复合物一般采用最终浓度为3%~4%PEG。 • 血清中加入最终浓度约为3.5%的PEG后，其浊度与血清中免疫复合物含量相关，用分光光度计测定其A值，代表免疫复合物相对含量。

31. 试剂和器材 • 试剂1：0.1mol/L PH8.6硼酸缓冲液 试剂2：3.75%PEG-硼酸缓冲液 • 仪器：721分光光度计

32. 操作方法 • 加样：对每一份标本，取两试管按下表操作

33. 操作方法 • 将以上反应管充分混匀，置室温1小时。 • 用721分光光度计在460nm波长下测定OD值。 • 关机，清洁仪器，盖上布罩。

34. 正常参考值：OD<0.17 • 结果易受多种大分子蛋白质的干扰，特异性差。 • 本试验还受温度变化如离心、洗涤时的温度的影响很大，重复性差。 • CIC的检出可以为多种与自身免疫相关疾病提供辅助诊断诊断指标，但由于方法上的问题，其测定结果尚不能作为诊断疾病的敏感可靠的指标。

35. 实验报告的要求 • 内容：题目、实验原理、试剂及器材、 实验步骤、实验结果（注明样本编号和原始数据）、讨论等。 • 实验报告由班长收齐后于下次实验课时交带习老师。