Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA

1. Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA Lucie Navrátilová 2. ročník MBB PřF UP v Olomouci 2007/2008

2. určení diagnózy co nejdříve medicína hledá rychlý, snadný a levný způsob identifikace bakterií

3. Bakterie • nejjednodušší jednobuněčné organismy, viditelné pod mikroskopem • patogenní Xnepatogenní

4. DNA(deoxyribonukleová kyselina) • nosič genetické informace v podobě sekvencí nukleotidů • podle rozdílností mezi geny se dají organismy identifikovat • GEN = sekvence nukleotidů s biologickou funkcí

5. Identifikace • určení izolovaného mikroba • souboru znaků mikroba porovnává se znaky identifikační maticí

6. Broad-range PCR-HRMA

7. PCR(Polymerase Chain Reaction) • biochemická reakce • využívá DNA-polymerázy ke klonování DNA • DENATURACE (94-96°C) • NASEDÁNÍ PRIMERŮ (cca 53°C) • EXTENZE (72°C)

8. HRMA(High-Resolution Melting Analysis) • identifikace bakterií na základě odlišností mezi tt jejich DNA • Tm = melting temperature

9. Příklad • zvolený gen leží v úseku 16S rDNA • zkoumané druhy bakterií: • Burkholderia cepacia • pickettii • Pseudomonas aeruginosa • Stenotrophomonasmalthophilia

10. Burkholderia cepacia http://www.wickipedia.cz

11. Pseudomonas aeruginosa http://www.wickipedia.cz

12. Stenotrophomonas maltophilia http://www.wickipedia.cz

13. PCR směs pro 1 reakci • destilovaná voda 14,24 μl • LCGreen 2 • DNA pufr 2 • dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 • primer F 0,1 • primer R 0,1 • rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl • templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl • Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

14. PCR směs pro 1 reakci • destilovaná voda 14,24 μl • LCGreen 2 • DNA pufr 2 • dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 • primer F 0,1 • primer R 0,1 • rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl • templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl • Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

15. PCR směs pro 1 reakci • destilovaná voda 14,24 μl • LCGreen 2 • DNA pufr 2 • dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 • primer F 0,1 • primer R 0,1 • rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl • templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl • Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

16. PCR směs pro 1 reakci • destilovaná voda 14,24 μl • LCGreen 2 • DNA pufr 2 • dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 • primer F 0,1 • primer R 0,1 • rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl • templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl • Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

17. PCR směs pro 1 reakci • destilovaná voda 14,24 μl • LCGreen 2 • DNA pufr 2 • dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 • primer F 0,1 • primer R 0,1 • rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl • templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl • Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

18. Obr.2: Aparatura pro PCR-HRMA Obr.3: RotorGene

19. DNA 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

20. Denaturace DNA 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

21. Nasedání primerů 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CTAATATC-5’ 5’-GCGATTAG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

22. Extenze primerů 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGG3’-CTAATATC-5’ 5’-GCGATTAG-3’GCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

23. Graf 1: Normalizovaný graf denaturované DNA fluorescence - normalizovaná teplota °C

24. Graf 2: Normalizovaný graf denaturované DNA fluorescence - normalizovaná teplota °C

25. Použitá literatura • deSilva D., Blackett J.,High-Resolution melting & Unlabeled probes Developing a Simple and Inexpensive Genotyping Assay with Lunaprobes, Genetic Engineering & biotechnology News, 27, publish on-line: http://www.genengnews.com/articles/chtitem.aspx?tid=1986&chid=1 • Votava M., Lékařská mikrobiologie - obecná, Neptun, 2005

26. Děkuji za pozornost!