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Département de Chimie Bioorganique

Les récepteurs ionotropiques de la famille nicotinique: Organisation moléculaire et mécanisme de fonctionnement. 8 janvier 2008. Thomas Grutter. Département de Chimie Bioorganique. Faculté de Pharmacie, Illkirch. grutter@bioorga.u-strasbg.fr.

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  1. Les récepteurs ionotropiques de la famille nicotinique: Organisation moléculaire et mécanisme de fonctionnement 8 janvier 2008 Thomas Grutter Département de Chimie Bioorganique Faculté de Pharmacie, Illkirch grutter@bioorga.u-strasbg.fr

  2. Vers une biologie structurale des neurosciences ? L’analyse du génome humain prédit que ~30 % des gènes codent pour des protéines membranaires (dont une grande proportion se trouve dans le SNC). ~ 47000 structures 3D déposées dans la Protein Data Bank (PDB) dont ~ 100 protéines membranaires (soit 0,2 % de la PDB -novembre 2007). http://www.mpibp-frankfurt.mpg.de/michel/public/memprotstruct.html Très large déficit de structures 3D de récepteurs membranaires impliqués dans la neurotransmission.

  3. La communication neuronale: une histoire de synapse Influx nerveux Neurone récepteur Synapse Neurone émetteur

  4. activation (ms) site de liaison canal ionique Na+ La synapse: relais moléculaire neurone pré-synaptique PA Ca2+ vésicules canaux Ca2+ voltage-dépendant Ca2+ + neuromédiateur récepteurs canaux neurone post-synaptique PA Na+

  5. Les trois familles de récepteurs canaux ? Na+ NH2 Glutamate ATP NH2 ACh CO2H membrane intracellulaire NH2 CO2H CO2H 3 5 4 1 4 1 3 1 2 2 3 2 P2X trimère iGluR tétramère nAChR pentamère

  6. La superfamille pentamérique AChBP bactériens (H+-gated) Bocquet et al. (2007) Nature445, 116-119 Canaux cationiques 5HT3A,B nAChR Na+, K+, Ca2+ GABAA GABAC glycine Cl- Canaux anioniques 1 milliard d’années

  7. Découverte des récepteurs bactériens Bocquet et al. (2007) Nature445, 116-119 Tasneem, et al. (2005) Genome Biology 6, R4

  8. Phylogénie des récepteurs cationiques A AChBP E AChBP: Acetylcholine Binding Protein 5-HT3 D B a10 C a9 a8 Récepteurs neuronaux homopentamériques a a a7 a a a5 a b3 a4 a2 Récepteurs neuronaux hétéropentamériques b a a6 a3 b b b4 a b2 a1 b1 a d Récepteurs musculaires (torpille) d g b g a e 400 600 200 0 800 (Millions d’années)

  9. Organisation moléculaire: Topologie des nAChRs synapse NH2 M1 M2 M3 M4 nAChRs S CO2H S S S membrane AChBP S S Résolution 4 Å (par ME) …presque atomique… cytoplasme synapse Na+ cytoplasme K+ 43K

  10. Structure globale et sites pharmacologiques a  ACh   ACh ACh BNC (basse affinité) a Ca2+ stéroïdes a ACh  ACh ACh Site des anesthésiques généraux   ACh P ACh a BNC (haute affinité)

  11. a1 Gly 1 ACh 4 b2 Gly Gly 1 1 b2 b2 Gly Gly a1 ACh 4 a1 b2 GABA BZD a7 ACh 7 1 g2 ACh GABA ACh 7 b2 7 ACh ACh a7 Pharmacologie de la super famille nicotine (agoniste basse affinité) nAChR (a7)5 a-BgTx (antagoniste compétitif haute affinité) nicotine (haute affinité) a-BgTx (aucune affinité) (a4)2(b2)3 Gly-R glycine (agoniste) (a1)5 strychnine (antagoniste compétitif) GABA-R GABA (agoniste) (a1)2(b2)2 g2 BZD (potentiateurs) ex: diazepam (valium)

  12. Marquage de photo-affinité Technique qui permet d’identifier les acides aminés qui participent au site de liaison d’un ligand (en absence de structure 3D) * * obscurité * lumière * * * * Liaison covalente ligand photo- sensible * * * Couplage récepteur Complexe irréversible Complexe réversible topographie d’un site N * C site * * * * * N C Proposition d’un modèle 3D

  13. Sites agonistes sur nAChR

  14. Sites non compétitifs et canal M2 M2 M2 E E Mep V V TID L L 247 S S CPZ T T Antagonistes non compétitifs (bloquants du canal)= mep (meproadifene), TID, CPZ (chlorpromazine)

  15. Quel est le mécanisme de la sélectivité ionique ? cationique anionique M2 - - + + - + M1 2’ - + -4’ -1’ - + 7-8 Å 5-6 Å hypothèse de la difference du diamètre du pore ?

  16. nAChR: un récepteur canal allostérique Patch-clamp Cell-attached ACh micropipette ACh Na+ Na+ Na+ Enregistrement d’une population de canaux Enregistrement d’un canal ACh fermé ouvert 2 pA 100 pA 50 ms 2 s Patch-clamp Whole-cell

  17. nAChR: un récepteur canal allostérique B B B B A B D A B A A A A D KD ~100 mM KD ~1 mM Na+ ACh + présence de coopérativité (n>1) réponse état B K+ absence de coopérativité (n=1) état A KD ~1 nM log agoniste état D “whole-cell” ACh “outside-out” f 2 pA o 100 pA 50 ms 2 s

  18. Modèles allostériques: KNF et MWC Modèle KNF ou « induced fit » L0 [B] [A].[F] A L0 = AKD = [A] [AF] AKD L1=L0c AKD AF c = BKD Ln=L0cn F a = AKD (1 + a)n [A] + [AF] + … + [AFn] = A= ([B] + [BF] + … + [BFn]) + ([A] + [AF] + … + [AFn]) L0.(1 + c.a)n + (1 + a)n ([BF] + … + [BFn]) + ([AF] + … + [AFn]) L0.c.a(1 + c.a)n-1 + a(1 + a)n-1 YF = = ([B] + [BF] + … + [BFn]) + ([A] + [AF] + … + [AFn]) L0.(1 + c.a)n + (1 + a)n Koshland, Nemethy, Filmer (1966) Biochemistry 5, 365-385 Monod, Wyman, Changeux (1965) J. Mol. Biol. 12, 88-118 B BKD [B].[F] BF BKD = [BF] BFn AFn

  19. Changement du L BAL [B] BAL = B A [A] Phénotype L: Si L-> 0 Si L-> ∞ L.c.a(1 + c.a)n-1 a(1 + a)n-1 F F alors, = YF = = YF = alors, F + BKD F + AKD (1 + a)n L.(1 + c.a)n et, A= 0 et, A= 1 fonction d’état fonction de liaison Lpetit A YF Lgrand F log F

  20. Changement du K AKD F c = a = BKD AKD Phénotype K: Si c= 0 Si c= 1 a(1 + a)n-1 F F YF = alors, alors, YF = = L+ (1 + a)n F + AKD F + BKD (1 + a)n 1 et, A= et, A= 1 + L L+ (1 + a)n fonction de liaison fonction d’état YF A F log F

  21. L2 = [B2]/[A2] = 102 L1 = [B1]/[A1] = 104 L5 = [B5]/[A5] = 10-4 L3 = [B3]/[A3] = 1 L4 = [B4]/[A4] = 10-2 99,99% A5 Mais alors d’où vient la coopérativité dans MWC ? L0 = [B0]/[A0] = 106 1.0 A0 99,9999% B0 A1 B0 B1 Fraction A A2 0.5 B2 DG = - RT ln L A3 B3 B4 A4 B5 0 A5 1.0 0 [F] AKD = 10-6 M BKD= 10-4 M c = AKD/BKD = 10-2 L1=L0c , L2=L1c , etc…

  22. Lpetit A Lgrand log F diminution de L0 en présence de calcium Application du modèle MWC: cas du site calcium a7 E172Q 640 mM ACh 640 mM ACh + Ca2+ + Ca2+ E172 ACh Ca2+ 1 mA 0,4 mA 4 s 4 s E172Q a7 + Ca2+ + Ca2+ sans Ca2+ potentiation EC50 = 27 mM sans Ca2+ EC50 = 111 mM I/Imax EC50 = 78 mM EC50 = 67 mM -6 -6 -3 -3 log ACh, M log ACh, M Galzi et al. (1996) EMBO J.15, 5824-5832

  23. A Lpetit Réponse normalisée A Lgrand log F Application du modèle MWC: cas du L247T L247T WT -7 -4 log ACh, M L247T MLA (antagoniste) ACh courant sortant L B A 1 mA courant entrant [B] 10 s L = [A] L247T = Phénotype L Revah, et al. (1991) Nature 353, 846-849

  24. Microscopie électronique: structure à moyenne résolution du canal Pentamère avec un pore central 4 hélices TM: résolution: 4.0 Å canal fermé Miyazawa et al. (2003) Nature423, 949-955

  25. M2 M2 M2 E E Mep V V TID L L 247 S S CPZ T T

  26. Structure RX de l’AChBP nAChR nAChR N C Ac-AChBP 30 - 40 % d’identité de séquence AChBP C N Ls-AChBP Bt-AChBP-2 Bt-AChBP (résolution: 2,7 Å) AChBP  20-25% d’identité de séquence avec le domaine N-terminal des nAChRs Smit et al. (2001) Nature 411, 261-268 Brejc et al. (2001) Nature 411, 269-276

  27. Rôle physiologique de l’AChBP Excrétée par les cellules gliales de l’escargot d’eau douce Lymnaea stagnalis, l’AChBP régule l’activité cholinergique au niveau de la synapse (par effet tampon). Smit et al. (2001) Nature 411, 261-268

  28. Structure RX de l’AChBP (2,7 Å de résolution) Organisation quaternaire: pentamère Structure du monomère: deux feuillets b enroulés l’un sur l’autre (sandwich b)

  29. AChBP : protéine homologue Composante complémentaire Composante principale Loop E Loop B L109 Y111 W149 Y117 Y151 L119 Loop A Y93 Site ACh W55 W86 Loop D E57 Y190 C192 D174 C193 E176 Y198 Loop C Loop F Modèle du site ACh sur nAChR Structure RX du complexe nicotine/AChBP Grutter and Changeux (2001) Trends Biochem. Sci. 26, 459-463

  30. AChBP : site de liaison du MLA (antagoniste compétitif) Hansen et al. (2005) EMBO J. 24, 3635-3646

  31. AChBP : site de liaison des antagonistes compétitifs Structure RX du complexe MLA/AChBP La pharmacologie moléculaire devient atomique… Hansen et al. (2005) EMBO J. 24, 3635-3646

  32. Nouvelle structure RX du domaine extracellulaire des nAChRs AChBP nAChR nAChR Dellisanti et al. (2007) Nat. Neurosci. 10, 953-962

  33. Modèle 3D du récepteur Domaine de liaison des agonistes (LBD) Domaine du canal ionique (IPD) M1 M2 M3 MA M4 N C N boucles de liaison N Site de liaison LBD * * 50 Å C C M2 1 2 3 4 Canal ionique IPD Intracellulaire MA MA

  34. Quel est le mécanisme d’activation ou ‘gating’? b-sandwich Transmission du signal ~ 50 Å hélices a D’ou vient la rapidité d’ouverture (~ µs à ms)? > 15000 atomes

  35. Création de chimères entre les deux domaines distincts 201 210 7-chick 7-human 1-Torpedo 4-human b2-human VTMRRRTLYY VTMRRRTLYY FIMQRIPLYF FVIRRLPLFY WTYDRTEIDL nAChR a1 Glycine a7 nAChR FHLERQMGYY FHLERQMGYY 1-human 2-human GlyR M1 (IPD) b10 (LBD) a7 NH2 S S CO2H 1 2 3 4 Gly a1 GlyR anionique a7 nAChR cationique chimère a7 /Gly

  36. Transfection et enregistrement des courants Phosphate/Ca2+ pMT3 24-48 heures cDNA cellules HEK Enregistrement Patch-clamp extracellulaire Electrode d’enregistrement ACh + + Vh = - 60 mV - - Cl- Courant entrant

  37. Chimère a7/Gly fonctionnelle…. site Ca2+ a 4 mM Ca2+ 300 mM DHbE b 1 mM ACh 10 mM ACh 500 pA 1 nA 3 s 2 s I (nA) c d + Ca2+ I/I10 mM no Ca2+ Vm (mV) Ise contrôle ACh, mM Mécanisme commun d’activation

  38. …seulement elle est lente à s’activer ! Limite de la perfusion 0.1, 1 ou 3 mM ACh kapp = 0.33 s-1 kapp (s-1) kapp = 0.93 s-1 1 nA 1 s kapp = 1.75 s-1 ACh, mM Cys-loop 127 141 7 7 1 4 b2 g d e CYIDVRWFPFDVQKC CYIDVRWFPFDVQHC CEIIVTHFPFDEQNC CSIDVTFFPFDQQNC CKIEVKHFPFDQQNC CSISVTYFPFDWQNC CPISVTYFPFDWQNC CAVEVTYFPFDWQNC nAChR CPMDLKNFPMDVQTC CPMDLKNFPMDVQTC 1 2 GlyR CPMHLEDFPMDAHAC CMMDLRRYPLDEQNC CQLQLHNFPMDEHSC 1 b2 g2 GABAR Couplage défectueux?

  39. Restauration du couplage GlyR fonctionnel par la Cys-L Cys-L M4 M1 M2 M3 C C a7/Gly C N a7(Cys-L)/Gly 7-nAChR a1-GlyR CYIDVRWFPFDVQKC CPMDLKNFPMDVQTC 10 mM ACh a7(Cys-L)/Gly 2 s kapp (s-1) a7/Gly a7/Gly a7(Cys-L)/Gly ACh, µM

  40. Par quel mécanisme? koff 1. En modifiant le kon de l’ACh KD = kon 2. En modifiant les propriétés de conduction du canal 3. En modifiant les constantes cinétiques intrinsèques du “gating” kBA canal fermé (état B) canal ouvert (état A) kAB

  41. Hypothèses 1 & 2 peu probables… ACh dose-réponse compétition ([125I]a-Bgtx) I/I10 mM B/Bmax ACh, mM ACh, mM 4 fermé ouvert c 2 pA a7/Gly g = 28 ± 4 pS o 50 ms 0 coups (x 1000) 6 g = 23 ± 4 pS a7(Cys-L)/Gly 0 pA 3 2 1 0

  42. Hypothèse 3…très probable c aire, ai ti (ms) 10 a7/Gly 2 pA o t1 = 0.75 t2 = 5.9 t3 = 42 t4 = 193 a1 = 0.20 a2 = 0.21 a3 = 0.28 a4 = 0.31 500 ms 5 0 50 ms 0 -4 -3 -2 -1 √Counts a7(Cys-L)/Gly 10 a1 = 0. 35 a2 = 0.35 a3 = 0.30 t1 = 0.89 t2 = 8.5 t3 = 65 5 0 -4 -3 -2 -1 0 Log open time (s) 10 mM ACh kBA état B (canal fermé) état A (canal ouvert) 2 s kAB Modification des constantes cinétiques intrinsèques

  43. Modèle cinétique traces expérimentales traces simulées ACh 1 s Current a7/Gly a7(Cys-L)/Gly 10 √Counts 5 0 0 -4 -3 -2 -1 Log open time (s) 10 5 0 -4 -3 -2 -1 0 actif état basal désensibilisé BAk0 ADk0 D0 A0 B0 ABk0 DAk0 AKD/5 DKD/5 BKD/5 BAk1 ADk1 D1 B1 A1 ABk1 DAk1 AKD/2 DKD/2 BKD/2 BAk2 ADk2 D2 B2 A2 ABk2 DAk2 AKD DKD BKD BAk3 ADk3 B3 D3 A3 ABk3 DAk3 2AKD 2DKD 2BKD BAk4 ADk4 D4 A4 B4 ABk4 DAk4 5AKD 5DKD 5BKD BAk5 ADk5 D5 A5 B5 ABk5 DAk5 B0 ABk0 A0 DAk0 BAL0= = ADL0= = A0 BAk0 D0 ADk0 8 inputs

  44. La Cys-loop stabilise l’état de transition kBA état B (canal fermé) état A (canal ouvert) kAB DkBA ~10x DkAB ~10x état de transition DDG = -1,36 kcal/mol DGBA = -RTln(kBA) (état A0) ouvert DGAB = -RTln(kAB) énergie libre (état B0) fermé coordonnées de la réaction

  45. Identification des acides aminés impliqués C C C N k (s-1) 0.1 1 10 ACh Cys-loop 127 141 a7/Gly C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 a7(Cys-L)/Gly CYIDVRWFPFDVQKC CPMDLKNFPFDVQKC CYIDVRWFPMDVQTC CYIDVRWFPMDVQKC CYIDVRWFPFDVQTC CPMDVRWFPFDVQKC CYIDLKNFPFDVQKC CYIDLKWFPFDVQKC CYIDVKNFPFDVQKC CYIDLRNFPFDVQKC CYIDLRWFPFDVQKC CYIDVRNFPFDVQKC CPMDLKNFPMDVQTC C9 a7(CyS-L)/Gly a7/Gly 1 s lents rapides La double mutation V131L/W133N suffit à restaurer le couplage fonctionnel de la chimère

  46. Réciprocité de la double mutation sur WT GlyR WT GlyR C C C N k (s-1) 1000 100 Cys-loop CPMDLKNFPMDVQTC CPMDVKWFPMDVQTC GlyR L142V/N144W 138 152 10 mM Gly 50 ms GlyR L142V/N144W Les deux résidus V142 et N144 sont critiques dans le couplage fonctionnel des GlyRs

  47. Restauration du couplage a7nAChR fonctionnel par la boucle M2-M3 boucle M2-M3 (2-3L) C C a7/Gly a7/(2-3L)Gly DSVPL -YVKA a1-GlyR 7-nAChR 10 mM ACh kopen (s-1) 1 10 2-3L DSVPL -YVKA a7/Gly 269 265 1 s a7/Gly a7(Cys-L)/Gly a7/(2-3L)Gly Réciprocité du couplage allostérique dans la superfamille

  48. Cys-loop et boucle M2-M3: zone de pivot dans le couplage allostérique 5HT3 Récepteurs cationiques nAChR Cys-loop 261 272 2-3L 127 141 7 7 1 4 b2 g d e CYIDVRWFPFDVQKC CYIDVRWFPFDVQHC CEIIVTHFPFDEQNC CSIDVTFFPFDQQNC CKIEVKHFPFDQQNC CSISVTYFPFDWQNC CPISVTYFPFDWQNC CAVEVTYFPFDWQNC PATSDSVPLIAQ PATSDSVPLIAQ PSTSSAVPLIGK PSTSLVIPLIGE PPTSLDVPLVGK PETSQAVPLISK PATSMAIPLIGK PETSLSVPLLGR GABAA Récepteurs anioniques GABAC nAChR Glycine 1 milliard d’années CPMDLKNFPMDVQTC CPMDLKNFPMDVQTC 1 2 PKVS-YVKAIDI PKVS-YVKAIDI GlyR CPMHLEDFPMDAHAC CMMDLRRYPLDEQNC CQLQLHNFPMDEHSC PKVA-YATAMDW PKIP-YVKAIDM PKVS-YVTAMDL 1 b2 g2 GABAR Grutter et al. (2005) PNAS102, 18207-18212

  49. Résultats expérimentaux en accord avec des simulations moléculaires du gating Taly et al. (2005) Biophys. J. 88, 3954-3965

  50. Mécanisme proposé d’ouverture du canal ionique a-hélices M2 (rouge) Cation hydraté (bleu)

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