Bakteriális kemotaxis

1. Bakteriális kemotaxis Kurzusvezető: Dr. Kőhidai László 2012.

2. A kemotaxis során megfigyelhető eltérő mozgási formák értelmezése

3. A baktérium ostor - 12-30nm { monotrich 5 lopotrich peritrich • Felépítő protein: • flagellin(53.000) • pentahelikális felépítés • gyors regeneráció (3-6 perc)

4. A baktérium ostor bazális testének szerkezete { ostor 22.5 nm „hook” { L rotor P 27 nm S M stator

5. A baktérium ostor rotációjának iránya és a mozgás-típusok közötti összefüggés CCW CW tumbling

6. R M Berry: Torque and switching in the bacterial flagellar motor. An electrostatic model. Biophys J. 1993 April; 64(4): 961–973

7. Egyenes szakaszok hossza Tumbling szám Gradiens Egyenes szakaszok hossza Tumbling szám Gradiens

9. E. COLI

10. E. COLI

11. A bakteriális kemotaxis és adaptáció A sejtek mozgására nem csupán a koncentráció-grádiens változása hat ! Az adaptációs mechanizmusok megléte e sejtek „primitív” memóriájának létélre utal.

12. dipeptidek cukrok aminosavak periplazmikus kötő/szállító molekulák kemotaxis receptporok intracellulláris szignalizációs út

13. Bakteriális cheotaxis receptorok kimutatása osztódási gyűrű receptor

14. Aszpartát receptor ligandkötő-hely „coiled-coil” domain metilációs helyek szignáltovábbító rész

15. O O C C O O Asp receptor részei ligandkötő hely metilációs hely 8 db szignál továbbító rész alap-aktivitásban

16. O O C C O O O O O O C C C C O O O O Asp kemotaxis receptor metilációja metiltranszferáz CH3 CH3 metilészteráz

17. CheA-P CheA CheA-P + CheY CheY-P+ CheA CheY + Pi CheY-P + CheZ Repellens molekula CheW , CheB-P 200 ms Mg2+ CW rotáció „tumbling” Mg2+

18. Attraktáns molekula CheA aktivitás CheY-P mennyiség H+ vándorlási iránya az ostor motor régiójában megfordul CCW rotáció „úszás”

19. Trg Tsr Tar Tap galaktóz ribóz Ni2+, Asp Leu, Ser dipeptidek CheR CheA CheW CheB-P CheZ CheB CheA-P CheY MOTOR CheY-P

20. Tsr CheB Tar CheA CheY CheW Trg CheZ Tap CheR Aer MotA =MotB Ser -m Asp +P FliG FliM FliN Maltóz MalE +P RbsB Ribóz -P MglB D-Gal Dipeptid DppA +m Gázok m = metiláció P = foszforiláció

21. Repellens molekulák CH3 CheY-P CheA CheB-P Che A-P CheY CheB CheA Receptor Effektor

22. NH3 Homocyst CheD CheR -CH3 H2O SAM CheV -P Methanol ADP -P CheB ATP H2O Pi Pi Sink P- CheA CheW CheZ L CheY CheY P- CheC CheX FliY Motor app

23. A CheY szerkezete

24. A ChA - ChY komplex

27. FlgK - a „hook” régió FlgD- hosszát szabályozza FlgB, C, G - összekötő „pálca” FliF - M-gyűrű Mot A - Transzmembrán proton-csatorna Mot B - Kapcsoló fehérje Fli G - CheY-CheZ Fli M- kapcsolat Fli N- Baktérium legfontosabb flagelláris proteinjei

28. Flagelláris proteinek • Több operonon elhelyezkedő, 30-nál több gén • határozza meg • Szintézisét, illetve expresszióját a Sigma 28 faktor • szabályozza • „Hook asszociált protein” (HAP) : • - a flagellin molekulák nukleációs helyét adja • - növeli a mechanikai ellenállóképességet • Fő fajtái: Fli, Flg, Flh

29. A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése • CheA - hisztidin autokináz • P1 - 22 aminosav, nem gátlódó régió • P2 - 25 aminosav, a CheY interakcióban • vesz részt • CheAL (long) - His48 autofoszforilálódik, mely • része a CheY és CheB aktiválódási • folyamatának • CheAL működése pH-függő. Optimális pH 8.1 - 8.9 • - ha a citopl. pH 7.6 alá csökken a Tar és Trg • receptorok továbbítanak szignált • ChAS (short) - kináz aktivitással rendelkező, de NEM • autofoszforilálódó alegység • - aminoterminálisan 97 as. szekvencia • hiányzik

30. A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése • CheA hyper kináz - pontmutáció a Pro337-nél, melynek • következménye a foszforiláció • sebességének növekedése • A CheA a CheV foszforilációját is irányitja • CheN - Bacillis substilisban található és homológ • E. coli CheA-jával

31. A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése • CheY - 128 as.-ból áll, foszforilációját a konformáció • megváltozása követi • számos pozícióban lévő as. helyzete változik, • pl.: 17, 21, 23, 39, 60, 63, 64, 66, 67, 68, 69, • 85, 86, 87, 88, 94, 107, 109, 112, 113, 114, • 121 • A Mg2+ jelenléte a CheY aktiválódásához elengedhetetlen • Mg2+ hatására a Lys109 - Asp 57 közötti sókötés • felszakad, ez lehetővé teszi a molekula • foszforilációját

32. Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése • MCP1 - Tsr, MCP2 - Tar, MCP3 - Trg, MCP4 - Tap • H1 - 97 kD pI 5.1; H2 - 86 kD pI 5.1; H3 - 76 kD pI 5.3 • DcrA - Hem tartalmú, 668 as.-ból álló, 2 hidrofób • szekvenciát tartalmazó oxigén szenzor, • mely a redox-potenciál változásaira reagál • (Desulfovibrio vulgaris) • Tlpc - 30% homológiát mutat az E.coli MCP-jével; • defgektusa esetén elmarad a pathológiás kemotaxis

33. Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése • A metiláció táplálékmolekula-függő folyamat (pl. E.coli) • Éheztetés hatására egy 43kD-os, membrán-asszociált • protein metilációja figyelhető meg; • - táplálék molekulák jelenlétében a metiláció leáll • A metilációs rendszer és a kemotaxis aktivációja • közötti kapcsolat a kemotaxis receptorok, illetve • szignalizációs folyamat alapvető evolúciós hátterére utal

34. -CH3 CARRIER -CH3 CARRIER Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése • MCP-k demetilálódása -CH3 Attraktáns MCP-CH3 gyors Metanol + CARRIER lassú A nem metilált intermedier „tumblingot” idéz elő, majd kialakul az ADAPTÁCIÓ

35. MCP-fluoreszcencia kimutatása eltérő fenotípusú sejtekben

36. Adaptáció - Tumbling

37. A sejtek elhelyezkedése optimális koncentrációt Jelentő gyűrűkben - adaptáció Ser gyűrű Asp gyűrű

38. Metiláció – Szénhidrát típusú ligandok hatása

39. Metiláció - időfüggés

40. Kemotaxis - Evolúció Metil-transzferázok CheR Homológia: E.coli metil-transzferáza metilálja a Bac. subst. MCP-jét Eltérés: Bac. subst. CheRB Adaptáció repellensekhez E.coli CheRE Adaptáció attraktánsokhoz

41. Kemotaxis - Evolúció Metil-észterázok CheB Homológia: Bac.subst. MCP E.coli CheB DEMETILÁCIÓ + ATTRAKTÁNS Bac.subst. CheB E.coli MCP DEMETILÁCIÓ + ATTRAKTÁNS A reakciók sebességét az MCP határozza meg

42. Kemotaxis - Evolúció Metil-transzferázok CheR Homológia: E.coli metil-transzferáza metilálja a Bac. subst. MCP-jét Eltérés: Bac. subst. CheRB Adaptáció repellensekhez E.coli CheRE Adaptáció attraktánsokhoz

43. Methanol-képződés dinamizmusa és a ligandspecifitás C. gelida E. coli B. subst.

44. Bac.subst. CheY • E.coli CheA CheY-P • Bac.subst. CheY-P • E.coli CheZ CheY Kemotaxis - Evolúció • Bac.subst. pozitív kemotaxis a esetén - CheY-P • E.coli pozitív kemotaxisa esetén - Chey-P • Bac.subst. és E. coli CheW 28.6% homológia • Bac. subst. CheB és E.coli CheY 36% homológia • Bac. subst. és E. coli - M gyűrű és pálca

45. Ca2+ hatása baktériumok kemotaxisára • Kimutatható egy 38kD-os Ca2+-kötő fehérje • Ca2+ csatorna gáltók (pl. verapamil, LaCl3) • a kemotaxis zavarát okozzák

46. Che A (kb. 650 AS) P1 P2 P3 P4 P5 N H C Foszforiláció RR-bdg. Dimer Katalít. CheW rec bdg. Che Y (kb. 120 AS) N C DD D T/S K Mg2+ bdg. Foszforiláció Katalít.

47. Sigma faktor Bas.test CheW Che ? Sigma28 CheY CheB • A Sigma28 faktort kódoló gén egy 26 kb-os operon része • A flagellin, a „hook-asszociált protein” (HAP) és • egyes motor proteinek szintézisét szabályozó régió • Hiánya: paralizált flagellum; MCP hiány

48. Bakteriális chemotaxis mérése 3-csatornás rendszerben