1 / 51

Dichroizm kołowy

Dichroizm kołowy. PODSTAWY. Zjawisko dichroizmu kołowego (CD) jest rodzajem spektroskopii absorpcyjnej pozwalającej na mierzenie różnic w absorpcji światła lewoskrętnie i prawoskrętnie spolaryzowanego kołowo. Jeśli wektor elektryczny oscyluje wzdłuż jednej linii, wówczas takie fale

olympe
Download Presentation

Dichroizm kołowy

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Dichroizm kołowy

  2. PODSTAWY Zjawisko dichroizmu kołowego (CD) jest rodzajem spektroskopii absorpcyjnej pozwalającej na mierzenie różnic w absorpcji światła lewoskrętnie i prawoskrętnie spolaryzowanego kołowo.

  3. Jeśli wektor elektryczny oscyluje wzdłuż jednej linii, wówczas takie fale elektromagnetyczne nazywamy spolaryzowanymi liniowo.

  4. Kiedy dwie fale spolaryzowane liniowo w dwóch różnych płaszczyznach, skierowane w tym samym kierunku, różnią się od siebie fazą mamy do czynienia wówczas z polaryzacją kołową

  5. Superpozycja dwóch fal o tych samych amplitudach, prostopadłych do siebie, różniące się od siebie fazą (+90o, - 90o)

  6. Kołowo spolaryzowane fale w medium absorbującym

  7. Próka optycznie nieaktywna Próka optycznie aktywna

  8. Światło spolaryzowane [OR] [q] (mdeg) – obserwowana eliptyczność

  9. Kołowo spolaryzowane fale w medium absorbującym o właściwościach optycznych

  10. Cetonia aurata Światło lewoskrętnie spolaryzowane

  11. Chilolobaacuta

  12. Świetlikowate, robaczki świętojańskie (Lampyridae)

  13. Całkowite wewnętrzne odbicie

  14. ABSORBCJA ŚWIATŁA Światło prawoskrętnie spolaryzowanle Światło niespolaryzowanle Światło lewoskrętnie spolaryzowanle Dla roztworu o A = 1 DA = 10-4 – 10-6

  15. ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA [] (deg*cm2*decimol-1) – eliptyczność molowa l (cm) – długość ścieżki optycznej c (mol/dm3) – stężenie substancji [] (mdeg) – eliptyczność

  16. ŚREDNIA ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA NA RESZTĘ AMINOKWASOWĄ n – ilość aminokwasów w białku

  17. Przejścia w obrębie grup amidowych: n* (~220nm) o* (~200nm)

  18. Elektryczny dipolowy moment przejścia amidowego n* (n*)(~220nm) Elektryczny dipolowy moment przejścia amidowego o* ( o*) (~200nm)

  19. Typowe widma struktur 2-rzędowych białek

  20. Poli -Lys in 25oC: pH 10.8 () pH 11.1 (after 15min in 52oC) () pH 7.0 (r)

  21. Widma Absorpcyjne oraz CD zredukowanego i utlenionego cytochromu c1

  22. Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynianiowego w 0.1M NaF pH 7.0 .... - dopasowane składowe  oraz  Sybtylizyna w 0.1M NaF pH 7.0

  23. Modelof doublecortin tandem C C - - DCX DCX N N - - DCX DCX

  24. Structure of the N-terminal domain of doublecortin N-term bbabbb a3 C-term a2 b2 b5 a1 b1 b4 b3

  25. Circular dichroism spectra of isolated domains and DCX-tandem of doublecortin  (deg  cm2  dmol-1) x 106 Tandem N-DCX C-DCX  (nm) Measurements were performed in 50 mM phosphate, 300mM NaCl, pH 7.0, protein concentration: 50M

  26. Widmo CD N-DCX of doublecortin 95oC 21oC

  27. Zależność stopnia sfałdowania białka od temperatury 0.1<Kden<10 0D 100 100N0 Tden (Tm) temperature denaturant ½[denaturant]

  28. Krzywa denaturacyjna N-DCX (25mM bufor fosforanowy, pH 6.0, DHden = 83.9 kcal/mol, Tden = 74.57 oC. CD Temperature (oC)

  29. Analiza krzywej denaturacyjnej an+bn[GdmHCl] - intensywność fluorescencji stanu natywnego au+bu[GdmHCl] - intensywność fluorescencji stanu zdenaturowanego m - zależność Gden od [GdmHCl] Gden - zmiana swobodnej entalpii denaturacji

  30. Fraction unfolded Tm = 40.5 oC, DHvH = 68.9 kcal/mol Temperature (oC) Denaturacja termiczna FGF Measurement was performed in 25mM phosphate pH 7.3, 0.7M GdmHCl, heating rate = 0.25 oC/min, protein conc.= 80 g/ml. The transition was monitored by the increase of fluorescence at 353nm on excitation at 280nm

  31. Denaturacja chemiczna FGF Fraction unfolded DG=5.53kcal/mol Gdm½ = 1.13 M m=4.8 kcal/mol M GdmHCl (M) Measurements were performed in 25mM phosphate pH 7.3, protein concentration =25g/ml. The transitions were monitored by the increase of fluorescence at 353nm on excitation at 280nm

  32. Thermal unfolding transition of N-DCX and DCX-tandem of doublecortin Measurements were performed in 25mM phosphate, 300mM NaCl, pH 7.0, heating rate = 1oC/min, protein conc.= 20 g/ml. Transitions were monitored by the changes of the CD signal at 220nm.

  33. pH titration ofN-DCX of doublecortin pH 8.0 7.0 5.9 5.0 4.0 3.0 2.0

  34. pH titration ofN-DCX of doublecortin

  35. FGF-1 - Heparyna fibroblast growth factor Asn 18 Lys 112 Lys 113 Asn 114 Lys 118 Arg 119 Arg 122 Gln 127 Lys 128 PDB: 1axm

  36. Widma CD mutantów FGF-1 Circular dichroism spectra of the wild-type of FGF-1 (○), V109I (■), H102Y (▲), L44F (Δ), F108Y (□) and H21Y (●) mutants.

  37. Denaturacja termiczna wariantów FGF-1 a b Normalized thermal denaturation curves of the wild-type (○), V109I (■), H102Y (▲), L44F (Δ), F108Y (□), H21Y (●) mutants monitored by changes of fluorescence (a) or ellipticity (b).

  38. Mutant TmDHTmDH (oC) (kcal/mol)(oC) (kcal/mol) WT 40.1 63.054.8 68.9 V109I 39.9 69.354.1 71.9 F108Y 40.7 66.254.6 74.3 H102Y 42.2 78.554.9 83.4 H21Y 42.8 67.356.6 83.3 L44F 43.1 72.554.6 87.4 Parametry denaturacji chemicznej mutantów FGF-1 w obecności heparyny Thermal induced unfolding were performed in 25mMphosphate, 1.5M Urea, pH 7.3, scan rate 0.25 oC/min. 10x molar excess of heparin were used. The transitions were monitored by the residual ellipticity at 227 nm

  39. Struktura trzeciorzędowa białek

More Related