Desenho de primer e otimizações de PCR Éderson Kido

1. Desenho de primer e otimizações de PCRÉderson Kido Com base em http://www.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htm Molecular Biology Techniques Manual

2. Fatores que afetam a PCR • Temperatura de denaturação • Se o ácido nuclêico é aquecido em tampão de força iônica < 150 mM de NaCl, a temperatura de denaturação fica < 100oC. Logo, a PCR trabalha entre 91-97oC. • A meia-vida da Taq Pol a 95oC é ~30min. Logo, o número de ciclos não supera muito em 30.

3. Temperatura de denaturação • Diminui após ~10 ciclos, pois o tamanho médio do DNA alvo também decresce. • moldes menores de 300bp (50% de CG) tem temperatura de denaturação de 88oC. • Tempo de permanência: denaturação da Taq. Em geral: 94oC – 1min. • Se reduzir o tempo, maior número de ciclos é possível. Se aumentar a temperatura, diminua o tempo.

4. Temperatura de anelamento (Ta) • Depende do tamanho e composição dos primers. • ~5oC abaixo do menor Tm do par de primers. • Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC • Se Ta for muito baixo, primers podem anelar em alvos similares e amplificar produtos não específicos. Se Ta for alto demais, a probabilidade do anelamento diminui e a quantidade de produto também.

5. Temperatura de anelamento • Maioria dos primers anelam em menos de 30 s, a não ser que Ta seja muito próximo do Tm ou primers muito longo.

6. Tamanho do primer • Geralmente de 18 – 22 bases • Seqüência de 16 bases: estatisticamente -> uma vez em cada 416 bases (~4 bilhões bases; ~ tamanho do genoma humano ou do milho). • Assim, seqüências maiores que 17 são específicas!

7. Primers degenerados • Primers com opções em diferentes locais • Amplificação de seqüências relacionadas em diferentes organismos . • TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT where Y = T + C, and N = A + G + C + T, • Degeneração diminui a especificidade dos primers, aumenta ocorrência de mismatches e background. • Base deoxiinosina pareia com qualquer base.

8. Primers derivados de alinhamentos múltiplos

9. Temperatura de elongação • Elongação ocorre a partir da temperatura de anelamento. • Em ~70oC, a extensão ocorre com ~100 bases/s (1 min é suficiente para produto de 2 kb; para 3 kb, até 3 min). • Normalmente 70-72oC, por 30s a 3 min.

10. Reação de PCR • Tampão de PCR: • 10-50 mM Tris-HCl pH 8.3, • até 50 mM KCl, >1.5mM MgCl2, • primers 0.2 – 1 uM (cada), • 50 – 200 uM (dNTP, cada) • BSA até 100 ug/ml, • Detergente não-iônico: Tween-20 ou Triton X-100 (0.05 - 0.10% v/v; previne agregação da enzima) • Modernos são proprietários

11. Considerações • PCR trabalha bem com tampão da transcriptase reversa: logo, síntese de cDNA com posterior PCR. • > 50 mM de KCl ou NaCl inibe a Taq, mas presença auxilia no anelamento. • [Mg2+] afeta anelamento, especificidade do produto, atividade enzimática... Primers, dNTPs e moldes quelam e seqüestram o íon. De 0,5 a 2,5 mM > [dNTP]. • Primers: <1 uM (a menos que sejam degenerados); geralmente 0,2 uM. • Nucleotídeos: ~50 mM (longos produtos exigem mais).

12. Número de ciclos • Depende da concentração do DNA alvo. • 40-45 ciclos amplificam 50 moléculas alvos até [ ] igual a 25-30 ciclos, com 3x105 moléculas. • Se o produto não for feito em 30 ciclos, reamplificar (20-30 ciclos) 1 uL, com novo mix.

13. Efeito plateau • Atenua o acúmulo do produto, qdo este atinge de 0,3 a 1nM. • Devido: degradação de enzima; depleção de dNTPs, primers; inibição pelo produto; competição por produtos não específicos; re-anelamento, etc

14. Nested PCR PCR1 detecta a partir de 1000 moléculas; PCR2 detecta a partir de 1.

15. Primer design • Tamanho: 17-28 bases; • Composição: 50% (C+G); • Deveria terminar (3´) em G ou C; • Tm entre 50-80oC; • Três ou mais Gs ou Cs (3´) podem causar mispriming em regiões ricas em G ou C (evitar); • Evitar primers com complementaridade de bases (dímeros de primers); • Evitar complementaridade de bases em mesmo primer (haipin, estruturas secundárias)

16. Problemas