MIKROORGANISMU ĢENĒTISKĀ ANALĪZE

1. MIKROORGANISMU ĢENĒTISKĀ ANALĪZE Ģenētiskā analīze - tā ir metode, kuras mērķis noskaidrot gēna stāvokli un aprakstīt tā īpašības..

2. MIKROORGANISMU ĢENĒTISKĀ ANALĪZE Ģenētiskā analīze sastāv no daudzām specifiskām metodēm, t.sk. , no mutacionālās un hibridoloģiskās analīzes.

3. MIKROORGANISMU ĢENĒTISKĀ ANALĪZE Ģenētiskās analīzes uzdevumi: • Identificçt gēnus, kuri atbild par noteiktu pazīmi; • Sadalīt genomu saistīto gēnu grupās; • Atrast atsevišķu gēnu novietojumu hromosomā; • Noteikt gēnu struktūru.

4. MIKROORGANISMU ĢENĒTISKĀ ANALĪZE Galvenā un specifiskā metode ir hibridoloģiskā analīze. Tā ir krustošanas sistēma, kura ļauj analizēt atsevišķas organisma pazīmes. Hibridoloģiskā analīze pēta vecāku pazīmju izpausmes hibrīdiem un to pēcnācēju pazīmju kvantitatīvo uzskaiti.

5. MIKROORGANISMU ĢENĒTISKĀ ANALĪZE Mutantu hibridoloģiskā analīze ļauj noteikt: • cik gēni atbild par noteikto mutācijas pazīmi, • vai mutācijas ir alēlas, • dominantas vai recesīvas. Reversiju hibridoloģiskā analīze ļauj noteikt, vai mutācijas ir īsteni atgriezeniskas vai arī supresoru tipa.

6. MUTATĪVĀ ANALĪZE Mutatīvā analīze - tā ir skaitliski precīza mutantu daudzveidības pētīšana, kā arī mutantu rašanās procesa noskaidrošana.

7. MUTATĪVĀ ANALĪZE Mutatīvu analīzi izmanto tikai ģenētiskās analīzes pirmajā etapā t.i. gēnu identifikācijai Gēnu identifikācija iespējama tikai ar gēnu spontāno vai inducēto mutāciju izpausmes palīdzību.

8. MUTATĪVĀ ANALĪZE Eikariotiem kodola mutācijas ir saistītas ar • hromosomu skaita, • hromosomu struktūras izmaiņām, • paša gēna izmaiņām. Baktērijām mutācijas saistītas tikai ar divu pēdējo tipu izmaiņām - nukleoīdu struktūras un paša gēna izmaiņas.

9. MUTATĪVĀ ANALĪZE Par cik fenotipa izmaiņas ir sekundāras attiecībā uz izmaiņām genotipā, tad gēnu idetifikācija baktērijām pamatojas uz izmaiņu uzskaiti, kas skar baktēriju morfoloģiskskās, bioķīmiskās un antigēnās īpašības, kā arī to jūtību pret dažādiem fizikāliem, ķīmiskiem un bioloģiskiem faktoriem.

10. MUTATĪVĀ ANALĪZE • Mutatīvu analīzi var iedalīt vairākos etapos: • mutantu sadalīšana grupās pēc fenotipiskās līdzības; • mutantu atlases sistēmas radīšana; • noteiktas klases mutantu parādīšanās biežuma izpēte.

11. Mikroorganismu pazīmes, kuras izmanto mutacionālajā analīzē Mutāciju var atklāt tikai apstākļos, kad izmainītā gēna funkcija nosaka organisma reakciju normu pēc tādām pazīmēm, kuru reģistrācija ir iespējama eksperimentā.

12. Mikroorganismu pazīmes, kuras izmanto mutacionālajā analīzē • Morfoloģiskās pazīmes. • Bioķīmiskās pazīmes. • Izturība vai jutība pret antibiotiskajām vielām, indēm, fāgu un vīrusu infekciju. • Fizioloģiskās pazīmes.

13. MUTANTU ATRAŠANAS METODES Mutantus var iedalīt dzīvotspējīgos un dzīvotnespējīgos ( to genotipā ir mutācija, kas letāla dotajos apstākļos) . Kā vienus, tā otrus mutantus ir iespējams eksperimentāli analizēt, bet to atklāšanas metodes ir dažādas.

14. MUTANTU ATRAŠANAS METODES Detalizētāk ir izstrādātas dzīvotspējīgo mutantu atklāšanas metodes. Visbiežāk pielietotā procedūra šai gadījumā satur divus momentus - klonēšanu un klonu novērtējumu pēc interesējošām pazīmēm.

15. Morfoloģiskos un pigmentu mutantus var redzēt tieši uz cietajām (agarizētajām) barotnēm pēc koloniju pazīmēm.

16. MUTANTU ATRAŠANAS METODES G.Bidls un E.Tatums ieteica metodi mikroorga-nismu bioķīmisko mutāciju konstatēšanai.

19. Otrējo koloniju uzskaite Uzsējot zarnu nūjiņas celmu lac- uz laktozi saturošas barotnes ar nelielu glikozes piedevu, šūnām izmantojot glikozi, lac- celmā veidojas nelielas kolonijas. Līdzko glikoze tiek izmantota pilnībā lac- šūnu dalīšanās apstājas, bet lac+ mutantās šūnas turpina augt un veido otrējās kolonijas. Otējās kolonijas var iekrāsot zilā krāsā, ja barotnei pievieno indikatoru, kas reaģē ar laktozes rūgšanas produktiem.

20. Visvairāk izplatītākās metodes dzīvotspējīgo mutantu selektīvai izdalīšanai var iedalīt sekojošās grupās: • auksotrofām aļģēm, sēnēm un baktērijām pielieto minimālās barotnes, uz kurām var augt tikai mutantas šūnas, kuras kļuvušas prototrofas attiecībā uz barotnē trūkstošo augšanas faktoru; • aļģēm, sēnēm un baktērijām pielieto barotnes ar antibiotikām un indēm, pret kurām izturīgas ir tikai mutantās šūnas;

21. baktērijām kā selektīvs aģents var kalpot specifisks bakteriofāgs, pret kuru izturīgas var būt tikai mutantas šūnas; • vīrusiem kā selektīvs faktors var kalpot specifisks saimnieka celms, kura šūnās var parazitēt tikai mutantas vīrusu daļiņas.

22. DZĪVOTNESPĒJĪGO MUTANTU ATRAŠANAS METODES Mutanta letalitāte (dzīvotnespējība) ir diezgan relatīvsjēdziens. Kāda mutācija var būt letāla vienos apstākļos, bet atļauj organismam eksistēt kādu citu apstākāļu kombbinācijā. Daudzas mutācijas ir nosacīti letālas.

23. Nosacītu letālu mutantu piemērs ir sēņu, baktēriju un aļģu auksotrofie celmi. Bez augšanas faktora tie iet bojā, tā pievienošana barotnei atgriež tiem spēju vairoties.

24. Cits piemērs - fāga temperatūrjūtīgie mutanti, kas iet bojā pie paaugstinātas temperatūras, bet vairojas pie 37C.

25. Ir zināms, ka daudzi auksotrofi kādu laiku neiet bojā uz minimālām barotnēm, kaut nespēj uz tām vairoties. Uz to balstās to uzkrāšanas metodes - auksotrofu uzkrāšanas penicilīnmetode unfiltrācijasmetode.

26. PENICILĪNMETODE Lai bagātinātu populāciju ar auksotrofām šūnām, izmanto penicilīna (kā arī dažu citu antibiotiku) īpašību nonāvēt tikai augošas (dalošas) šūnas. Tā kā antibiotika šūnu suspensijai tiek pievienota minimālā barotnē, tad dalās un no penicilīna iet bojā lielākoties tikai prototrofas šūnas.

27. PENICILĪNMETODE Ja līdz apstrādei uz katrām tūkstots dzīvām šūnām ir sastopama kaut viens auksotrofs, tad pēc apstrādes ar penicilīnu relatīvi šis skaits var palielināties 100 un vairāk reižu.

28. Filtrācuja Bagātināšana ar filtrāciju pielietojama micēliju sēnēm un pamatojas uz to, ka prototrofās šūnas dalās un veido lielas filtru aizturošas daļiņas, bet nedalošās auksotrofās šūnas izskalojas filtrātā.

29. “Starvation”- badošanās Auksotrofi, kam nepieciešami vitamīni, reizēm sāk dalīties arī minimālā barotnē, bet pēc tam iet bojā no nesabalansētas vielu maiņas.

30. “Starvation”- badošanās Papildus mutācija, piemēram, radusies vajadzība pēc prolīna, var novērst šūnu dalīšanos un sekojošu to bojāeju.

31. “Starvation”- badošanās Aukstrofam pēc biotīnaAspergillus nidulans celmam pēc sporu apstrādes ar UV stariem rodas liels skaits jaunu mutāciju, tai skaitā arī auksotrofas.

32. Palielināt šūnu koncentrāciju ar divām mutācijām var, sporas ilgstoši turot minimālā barotnē. Sporas, kam ir vajadzība tikai pēc biotīna, sāk dalīties un iet bojā no bada, divkāršie auksotrofi neaug un tā saglabā savu dzīvotspēju.

33. Šādu auksotrofu uzkrāšanas metodi sauc par starvācijas metodi (no angļu val. “starvation”- badošanās).

34. Letālās mutācijas ar nenoskaidrotu augšanas vajadzību izdodas noskaidrot tikai retos gadījumos. Tā, piemēram, pelējumiem var izpētīt recesīvās letālās mutācijas tikai pateicoties šā tipa mutantu saglabāšanos heterokariotiskā micēlijā, kas satur dažāda tipa kodolus.

35. Eksistē vēl dažas citas selektīvas metodes specifisko mutantu atrašanai un savairošanai. Tā, piemēram, hlamidomonādas nekustīgie mutanti var uzkrāties starp šūnām, kas nosēdušās trauka dibenā, jo aktīvi kustīgās šūnas koncentrēsies labi aerētajā un apgaismotajā trauka augšdaļā.

36. Tādejādi ģenētiķiem ir pietiekami efektīvas metodes, lai izdalītu jebkura tipa mikroorganismu mutācijas, arī letālās. Pateicoties tam, mutāciju daudzveidība ir pieejama eksperimentālai izpētei.

37. Bioķīmisko mutantu analīze dažādām mikroorganismu grupām - baktērijām, sēnēm, aļģēm - liecina, ka mutāciju spektrs šīm grupām ir līdzīgs.