MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

1. MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

2. 1- INTRODUÇÃO POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS? QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?

3. 1- INTRODUÇÃO 1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: Especificidade Diversidade Memória Especialização Autolimitação Não reatividade ao próprio

4. 1- INTRODUÇÃO 1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: Especificidade – conferida por duas moléculas principais: - TCR – presente na membrana de linfócitos; - Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.

5. 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos IgM IgG IgA IgE IgD

6. 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos: IgM IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade IgA IgE IgD

7. 1- INTRODUÇÃO 1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos: -Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado. Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas. Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac.

8. 1- INTRODUÇÃO 1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos: -Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e detecção da interação Ag-Ac. Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.

9. 1- INTRODUÇÃO 1.4- Fatores a serem analisados na escolha do método: Sensibilidade; Especificidade (confiabilidade de resultados); Custo; Disponibilidade de material; Segurança; Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada; Tempo de realização do método.

10. 1- INTRODUÇÃO 1.5 – Aplicações dos métodos: - Identificação e/ou quantificação de moléculas específicas em fluidos biológicos; Purificação de proteínas; Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e hipersensibilidades; Identificação de genes e seus produtos; Localização de moléculas específicas em células e tecidos.

11. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS HISTÓRICO CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS de

12. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.1 - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação: Primeiros testes a serem desenvolvidos: Realizados em meio líquido; Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização – Baixa Especificidade; Não possuem metodologias eficazes para a detecção da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade.

13. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.2- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar). Diversos tipos: Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente; - Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.

14. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.2- Imunodifusão: Memória Não reatividade ao próprio

15. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.2- Imunodifusão: Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas. - Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais. Não reatividade ao próprio

16. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos. - Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac; Variações no método: Inibição da Hemoaglutinação. Não reatividade ao próprio

17. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.3- Hemoaglutinação: Memória Não reatividade ao próprio

18. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.3- Hemoaglutinação: Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido; Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade, devido a mal armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos. Memória Não reatividade ao próprio

19. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac. Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.

20. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento:

21. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento: Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo; Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.

22. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor; Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

23. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Competição Sanduíche

24. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5.1- ELISA Indireto:

25. ELISA “SANDWICH” TMB Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Outros componentes do soro Enzima Peroxidase Anticorpo conjugado

26. ELISA DE COMPETIÇÃO TMB Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Outros componentes do soro ST-AV- Peroxidase Antígeno biotinilado

27. ELISA DE CAPTURA IgM inespecífica TMB Anticorpo anti-IgM ST-AV- Peroxidase Antígeno biotinilado IgM a ser detectada

28. ELISA INDIRETA Anticorpo conjugado IgM a ser detectada Antígeno purificado IgM inespecífica TMB

29. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA:

30. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

31. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos. Métodos de alta especificidade e alta especificidade Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).

32. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:

33. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular. - Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.

34. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares.

35. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:

36. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:

37. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot: Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes; Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.

38. 3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas & Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier Editora Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P. Sittes & Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan Editora. Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta Edição. Roca Editora. Imunologia. David Male, Ivan Roitt & Jonathan Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora. Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. Charles Janeway, Paul Travers & Mark Walport & J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed Editora. Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray Edwards. Oxford University Press. Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow & David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.