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Quantification des ARNm par RT & PCR « en temps réel »

Quantification des ARNm par RT & PCR « en temps réel ». UMR 5123 – Anne MORALES & LAURENT BEZIN. ARNm (AUCG). RT. ADNc d(ATCG). Annexe II. PCR conventionnelle. ADNdb d(ATCG). Annexe III. Standard Concentration connue Nombre de copies déterminé. Préparation du standard.

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Presentation Transcript

  1. Quantification des ARNm par RT & PCR « en temps réel » UMR 5123 – Anne MORALES & LAURENT BEZIN

  2. ARNm (AUCG) RT ADNc d(ATCG) Annexe II PCR conventionnelle ADNdb d(ATCG) Annexe III Standard Concentration connue Nombre de copies déterminé Préparation du standard QUANTIFICATION Etalonnage • Migration sur gel (vérification taille) • Purification après prélèvement sur gel • Eventuellement séquençage STANDARD « d(ATCG) » • Dosage très précis • Détermination du nombre de copies

  3. ARNm (AUCG) ARNm (AUCG) RT RT ADNc d(ATCG) ADNc d(ATCG) PCR conventionnelle PCR en temps réel ADNdb d(AUCG) ADNdb d(ATCG) Standard RT & PCR en temps réel Préparation du standard • Migration sur gel (vérification taille) • Purification après prélèvement sur gel • Eventuellement séquençage Dans un « run » STANDARD « d(ATCG) » Echantillons Blanc de PCR (H2O) • Dosage très précis • Détermination du nombre de copies

  4. ARNm (AUCG) RT ADNc d(ATCG) PCR en temps réel UNG ADNdb d(AUCG) ADNdb d(AUCG) Dégradation de tout ADN contaminant amplifié en présence de dUTP Standard RT & PCR en temps réel Dans un « run » STANDARD « d(ATCG) » Echantillons Blanc de PCR (H2O)

  5. Rapidité • Limitation maximale de la présence de RNAses • Travailler sur la glace • Congélation rapide (azote liquide) des prélèvements Prélèvements tissus / cellules Extraction Purification des ARN totaux Annexe I Vérification Ø ADN génomique Transcription inverse des ARN messagers Annexe II

  6. Préparation des ARN totaux: (Annexe I) • Ce protocole permet de doser, sur un même échantillon: •  les ARNm et les protéines (+ autres si nécessaires) • Azote liquide • Cycles de congélation et décongélation / broyage mécanique • Limitation maximale de la présence de RNAses • Extraction des ARNm en milieu liquide • Utilisation de TRIzol ou TRI-reagent LS (Liquid Sample) • Traitement à laTurbo DNA free (Ambion) • Dosage précis des ARN totaux sur Biophotomètre (Eppendorf) • Analyse de la qualité des ARN totaux sur Bioanalyseur (Agilent) • Vérification de la non-contamination en ADN génomique • (sur 25 ng d’ARN totaux) • Ajustement de tous les ARN totaux à la même concentration.

  7. Pourquoi 25 ng d’ARN totaux pour la vérification de non-contamination en ADN génomique ? RT = 500 ng d’ARN totaux Contribution des ARN totaux aux acides nucléiques totaux à l’issue de la RT 500 ng d’ARN totaux pour 100 µL, soit: 5 ng d’ARN totaux / µL Ajustement du volume à 100 µL PCR quantitative sur 5 µL de RT ajustée à 100 µL = 5 µL x 5 ng/µL = 25 ng

  8. Détermination des séquences nucléotidiques utilisées pour l’amplification • Récupérer la séquence nucléotidique à amplifier dans une banque de données (Genbank par exemple, en passant par nucléotides): • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi • Transformer la séquence dans un format FASTA. • Rechercher dans la région d’intérêt la séquence des amorces optimales pour l’amplification: • http://www.basic.nwu.edu/biotools/Primer3.html • Rechercher si les amorces sélectionnées sont spécifiques de la séquence à amplifier: • http://www.infobiogen.fr/services/analyseq/cgi-bin/blast2_in.pl

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