Identificación de Levaduras de interés clínico

1. Identificación de Levaduras de interés clínico Lic Stuchi Viviana G Depto Microbiología IDIM A. Lanari

2. Características generales • Hongos unicelulares • Eucariotas • Son heterótrofos • 623 especies distribuidos en 60 géneros taxonómicos • Amplia distribución en la naturaleza ( en frutas, granos, miel, alimentos con contenidos en azúcar, suelo, aire, mar ( saprobios), piel, intestino, mucosas de mamíferos ( comensal). • Utiles y perjudiciales para el hombre • No forman parte de la flora humana normal, exepto C albicans, C parapsilosis y Malassezia sp

3. Identificar los aislamientos a nivel de especie • situación actual • Controlar a t= t1,…tn, la aparición de nuevas especies en el nosocomio • incidencia, perfil de R a antifúngicos • Comparar con centros homólogos • Realizar estudios de sensibilidad cuando hay fallas en el tto • Confirmar posibles brotes ( técnicas de BM)

4. Criterios básicos para identificación de levaduras Forma de reproducción vegetativa anamorfo o asexual teleomorfo o sexual

5. Formas de reproducción asexual • Brotación Origen de la pared celular (holoblástica o enteroblástica) Posición en que se producen ( mono –bi—multipolar) Forma en que se producen los brotes sucesivos (simpodial, en cadenas, acrópetas o basípetas) • Fisión • Producción de conidias sobre un corto cuello • Formación de balistosporas

6. Micromorfologia (EXT DE MALTA LIQUIDO) Características de la fase vegetativa Forma de las células vegetativas o blastoconidias Formación de pseudomicelio: formación de cadenas de células elongadas que se originan por gemación Formación de hifas verdaderas ( micelio) Formación de artroconidias

7. Características sexuales • Formación de ascos/ascosporas Agar gorodkowa Agar acetato de sodio Agar harina de maíz (Hansenula anomala, S cerevisiae)

8. Cultivo en lámina o microcultivo • Morfología, producción de clamidosporos, pseudohifas y blastoconidias • Medios de cultivo APG, Agar Morfología, Agar harina de maíz, Agar leche + Tween 80 al 1% Trazo con el cultivo de levadura Portaobjetos agar

9. Algoritmo para la identificación de levaduras *

10. Pigmentadas de color rosa o salmón Urea + No pigmentada. Color Blanco o crema Rhodotorula spp Identificación En agar cromogénico c/atb se visualiza a las 24 hs colonias puras, la siembra del material original permite detectar mas de un tipo de levadura e identificación presuntiva de C albicans, C krusei y C tropicalis

11. Agar Cromogénico CHROMagar Candida Otras levaduras +Cryptococcus, +Trichosporon

12. Negativo Positivo (h/3hs) Micromorfología (AM+EXT Malta liq ) +Agar cromogénico Candida albicans Identificación presuntiva Identificación definitiva

13. Colonias en Chromagar verde esmeralda • Tubo germinativo : positivo • Crecimiento en extracto de malta formación de película : negativo pseudohifas o hifas verdaderas : positivo • Crecimiento a 45°C en SDA Candida albicans : positivo Candida dubliniensis : negativo

14. Formación de clamidosporos en • agar harina de maíz . • clamidosporos terminales • Candida albicans • clamidosporos en paquetes de 3-5 • Candida dubliniensis • Incubar a 25-28°C, 48-72 • Observación al MO: 10x, 40x

15. Colonias en CHROMagar azul • Tubo germinativo : negativo • Crecimiento en extracto de malta formación de película : positivo pseudohifas o hifas verdaderas : positivo • Formación de clamidosporos en agar harina de maíz : negativo • Asimilación de trehalosa : positivo (+ 3 hs) Candida tropicalis

16. Colonias en CHROMagar rosa • Tubo germinativo : negativo • Crecimiento en extracto de malta formación de película pseudohifas o hifas verdaderas • Asimilación de trehalosa • Asimilación de melibiosa

17. C krusei C glabrata C parapsilosis Fotos :Guia de identificacion presuntiva de levaduras de interés médico.

18. Película (Ext de malta) + - C krusei C parapsilosis /C guillermondii / C glabrata Pseudohifas o hifas verdaderas + - C guillermondii /C parapsilosis después de 7 ds C glabrata después de 14 ds

19. Trehalosa + - C glabrata (antes de las 3 hs) C krusei/ C guillermondii C parapsilosis Melibiosa + - C guillermondii C parapsilosis / C glabrata

20. Colonias en CHROMagar blanco marfil • Tubo germinativo : negativo • Crecimiento en extracto de malta • formación de película • pseudohifas o hifas verdaderas • Urea de Christensen: • Agar semilla de girasol : positivo ( colonias marrones) Cryptococcus neoformans • Asimilación de inositol • Asimilación de trehalosa y otros sustratos

21. Urea + - Cryptococcus spp Rhodotorula glutinus Rhodotorula rubra C parapsilosis / C catenulata/ C famata C kefyr/ C lusitaneae/ C pintolopesii C rugosa/ C zeylanoides Hansenula anomala/ P wickerhamii Inositol + - Cryptococcus spp Rhodotorula spp

22. Especie de Levadura Micromorfología CHROMagar Trehalosa Urea Calbicans Pseudomicelio con blastoconidias agrupadas clamidoconidias Verde Neg Neg C tropicalis Pseudomicelio largo y ramificado, blastoconidias dispuestas a lo largo Azul Neg Pos +3hs Pseudomicelio corto ramificado, blastoconidias ovoides C parapsilosis Crema ND Neg Neg C krusei Células alargadas con blastoconidias terminales Rosa seca Pos débil Neg C glabrata Blastoconidias pequeñas sin pseudomicelio Rosa, crema, ND Neg Pos 2 hs

23. C guilliermondii Blastoconidias pequeñas c/ pseudo micelio rudimentario ND Neg Neg Cryptococcus neoformans Levaduras redondas brotantes ND Neg Pos Blastoartroconidias Clamidoconidias intercalares Azul violáceoND Trichosporon spp Pos Neg ND: no se distingue por color

24. Marcha mínima • Crecimiento a 37°C • Ausencia de micelio verdadero o pesudomicelio • Fenoloxidasa (+) • Test de ureasa(+) Identificación presuntiva de Cryptococcus neoformans

25. Cápsula de polisacárido visible examen directo con tinta china A: 100X

26. Identificación ID 32C 2 ml de H2O estéril Inóculo 2 Mc Farland 250 ul 135 ul por pocillo

27. 92% de aislamientos comunes 85% de los aislamientos raros Resultados: biocódigo de 8 dígitos identificación a través de un manual de códigos API WEB on line

28. 1. Prueba de formación de tubo germinativo por Candida albicans. 2. Prueba de formación de clamidosporas por Candida albicans. 3. Agar semillas de girasol para diferenciación de Cryptococcus neoformans. 4. Prueba de la producción de ureasa para Cryptococcus neoformans. 5. Crecimiento a 28 ºC y 37 ºC. 6. Crecimiento en extracto de malta para estudio micromorfológico. 7. Cultivo en lámina en agar morfología (Difco) para estudio micromorfológico. 8. Crecimiento en agar morfología (Difco) para macromorfología. 9. Ensayo de asimilación de Glucosa, Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa, Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa, Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácido cítrico, eritritol y m-Inositol. 10. Ensayo de asimilación de nitrato de potasio y peptona. 11. Ensayo de fermentación de Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa y Lactosa. 12. Crecimiento en medio libre de vitaminas. 13. Producción de ascosporas. Pruebas diferenciales para identificar levaduras por el método de referencia

29. Características fisiológicas y bioquímicas • Fermentación de compuestos carbonados(zimograma).Utilización de azúcares en anaerobiosisAsimilación de compuestos carbonados y nitrogenados (auxonograma)Utilización oxidativa (asimilación) de determinados compuestos C y N

30. Marcha identificatoria de levaduras • Medio urea • Incubar: 28°C, 72 hs Medio urea Incubar: 28°C, 72 hs Cepa pura Repique en YM Extracto de Malta líquido Incubar: 28°C, 72 hs Observar micromorfología 28°C y 37°C 24 hs Inóculo: 2-3 Mc Farland 5 ml de agua estéril

31. Fermentación de: Glucosa- Galactosa-Maltosa- Sacarosa-Lactosa-Celobiosa Lectura: 3-5-10 y 15 días Temperatura: 28°C Sembrar 0,1 ml /tubo Asimilación de azúcares Sembrar 0,5 ml / tubo . Asimilación de Nitrogenados . . . . . Leer a las 48-72 hs a 28°C . 0,5 ml

32. C C C 0 0 0 3 10 20 19 16 19 16 16 13 6 9 13 13 20 20 21 2 4 C N C 1 12 7 17 18 5 15 8 11 14

33. Agradecimientos Departamento Micología INEI– ANLIS“Dr. Carlos G. Malbran Departamento de Microbiología IDIM A. Lanari

34. Muchas Gracias!!!!