基因工程 基本原理 及技术

1. 基因工程 基本原理 及技术

2. 基因克隆(gene cloning )：是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增（也包括目的基因的无细胞扩增-PCR）的技术。基因表达(gene expression)：是基因的转录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。

3. 基因工程（gene engineering）或称重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指将获取的目的基因片段在体外与载体DNA通过人工剪切、编接构成DNA重组体，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程.

4. 基因工程基本步骤目的DNA 制备；载体DNA选择↓DNA体外重组技术 ↓ （ DNA酶切实验、 连接实验）重组DNA的转化（转染）试验↓

5. 重组克隆的筛选与鉴定（重组体的表型筛选，指纹图谱法，PCR方法，探针杂交法 ） ↓ 目的基因表达产物的筛选与鉴定（遗传互补法，免疫化学法－Western印杂交法，微细胞法(microcell method)

6. 图l 基因工程操作流程

7. 一.基因克隆( 一) “工程原料”的获取 -获取目的基因基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。获取目的基因 有三个途径：1.从生物基因组中分离纯化（鸟枪法－shotgun）：原核细胞DNA遗传背景不清。组建基因文库→ 检测鉴定。

8. 2.人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因。2.人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因。 用于结构清楚、分子量较小的基因 3.酶促合成法-反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因. mRNA→逆转录→ cDNA做目的基因 。可PCR法合成。

9. Principle of PCR DNA polymerase use single strand DNA as template to synthesize new DNA in vitro,(dNTP;Buffer;Mg2+,Primers) Chain reaction: Repeated cycles of reaction under the same condition.

10. The PCR reaction Denature 95ºC Extend Primers 72ºC Anneal Primers 45-68ºC template Primers, dNTPs, Taq polymerase, Mg2+

11. What do we achieve by cycling temperature in the presence primers, dNTP, Taq polymerase? Anneal primers Round 1 Extend primers

12. The exponential amplification of the gene in PCR The first 4 cycles of a PCR reaction in detail. In the 3rd cycle two double strands of the right length are copied(the forward and reverse strand are the same in length).In the 4th cycle, 8 double strands of the right length are copied.

13. Optimum condition of PCR • Correct sources of template DNA • Best temperature select in three steps • Appropriate primers in both end • Others: Mg2+; Inhibitor……et al.

14. Primer Design Is Vital • Primers should usually be 18-25 bases long • Need as much sequence information as possible outside target • 3’ end of primer is most important: best to have G or C at end • Primers should have approximately equal melting temperatures • Avoid repetitive sequence( internal hairpin structures) • Aim for 40-60% G+C content • Avoid complementarities within or between primers • Can modify 5’ ends to add restriction sites etc

15. TA Cloning Of PCR Products Requires “A” s A A PCR product Taq- yes Pfu- no pGEM-T pCR 2.1-TOPO

16. Typical Reaction Mixture25 or 50µl in a micro Eppendorf(0.5ml) tube

17. The Perfect Result Reliable PCR form every Sample

18. (二)、载体载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。载体应具备下列条件：(1) 有复制起点，能自我复制；(2)具有高效调控表达系统；(3)对某一种限制酶只有一个切点；(4)必须有一种选择性遗传标记；(5)携带外源基因的幅度宽；(6)分子量小，拷贝数多.

19. 载体的种类按来源分： 质粒载体(plasmid vector)原核、噬菌体载体(phage vector)原核、柯氏质粒载体(cosmid vector)真核、病毒载体(virus vector )真核.按作用分：克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、穿梭载体(shuttle vector)

20. 1.质粒载体: (1)分子量较小,在细菌中有较多的拷贝数。 (2)松驰型:质粒复制与染色体不同步和蛋白 质合成功能无关。 (3)具有一个以上的标志，便于筛选。 (4)具有数个或一个单一的酶切点。 天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322 ，pUC19。

21. LacZ Ampr→ o p ori

22. 2. 噬菌体载体 野生型λ噬菌体 (Wild type phage ，wt λ) DNA长度约为48.5kb (分子量3.2×107)，在病毒颗粒中为双链线形分子，具有12bp的粘性末端(cohesive end)，进入大肠杆菌之后立即互补成环。 入噬菌体作为克隆载体有两个优点： 1)转染效率高 :可在体外包装，产生有感染性的噬菌体颗粒，每个颗粒都可能感染一个大肠杆菌. 2)筛选程序简便:一定长度的噬菌体才能包装. 现改建的载体类型有：插入型载体如λgt11; 替换型载体EMBL3、EMBL4 。

23. 3. 柯氏质粒或称粘尾质粒(cosmid) 是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入DNA c o s区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。cosmid的构造特点: (1)含有抗药标志和复制起始部位。 (2)一个或多个单一酶的限制位点 (3)带有入噬菌体粘性末端。 (4)分子小，约4—6kb，可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。 另外，由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。 如 cosmid pHC79

24. 4．病毒载体 常用的动物病毒表达载体可分为两大类： 整合型（integrated）载体．即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40－PSV系列和逆转录病毒－逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。 游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。

25. 5．克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。常用载体pUC18 pUC 19. 6．表达载体(expression vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译。

26. 7．穿梭载体(shuttle vector) 又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体. 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效 率。如pKSV一10、pJDB219载体等。

27. kmram2 ori P oLacZ

28. （三）.限制性核酸内切酶限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行DNA分子切割的特殊工具。因此它有“分子剪刀”或“分子手术刀”之称。1、概念：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease ) 是指能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。2、识别序列的特点(1)专一；(2)常由4—6个碱基组成；(3)具有回文序列(palindromic sequence)

29. 切口类型：(1)形成粘末端(cohesive end)：DNA分子末端的单链片段能与其他DNA单链片段互补配对形成双链者，这两个DNA分子末端单链片段即为粘末端：如BamHⅠ 5` -G↓GATCC-3` 3` -CCTAG↑G-5`↓ 5`-NNNNNN-GGATCC-NNN-3` 3`NNNNNN-CCTAG G-NNN-5`（2）形成平末端；SmaⅠCCC↓GGG GGG↑CCC

30. 4、酶切反应条件： （1）需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。 DNA 的浓度不宜过高，高浓度的DNA 会使溶液的粘待度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA）（2）合适的酶量：酶和底物比例2~10u/ug DNA,避免使用过高的酶浓度

31. （3）合适的反应介质（缓冲体系）：反应均以Tris-Hcl作缓冲液；PH值多在7.4~8.0之间；反应需要Mg2+激活；多数酶反应尚需要2—巯基乙醇（BME）或二硫基苏糖醇（DTT）的存在。此外，许多酶反应还需要NaCl ，但不同的酶对NaCl的需要量各有差别。 （4）温度和作用时间等：大多数限制酶的反应温度为370C，个别酶则需要500C、600C或650C的高温。一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用1~5单位的酶，保温1~2小时。

32. (四) DNA重组(连接)和基因转移1、DNA重组（DNA recombination）不同的DNA片段之间的连接需要另一种工具酶--连接酶的帮助. 目的DNA酶切片断＋载体DNA酶切片断 ＋T4DNA ligase DNA重组体.T4DN 连接酶(T4DN ligase):是从感染T4噬菌体的E．coli中分离得到的一种连接酶，其催化两个DNA片段的3`一0H与5`一P末端形成磷酸二酯键。

33. （1）粘末端连接(cohesive end ligate)： （a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5`端P基团，使5`端带一OH)处理载体，可防止载体自身环化。 （b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。

34. (2)平末端连接(blunt end ligate)：目的基因和载体用同一种能产生平末端的酶切割后连接，重组后保留原来的酶切位点，如Smal CCCGGG 所用酶量要大. 连接反应条件 连接酶的活性; DNA的纯度, 载体与目的基因的比例; PH值7.2-7.8适宜; 镁离子、DTT(二硫基苏糖醇,有促进连接作用);ATP；; 14℃(不高于16℃)过夜。

35. 2、基因转移（gene transfer）把重组DNA导入受体细胞进行扩增.根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞及选择适宜的转化或转染的方法。

36. (1)受体细胞：大肠杆菌E.coli （EK系统）；优点: 细菌细胞作为表达系统的优点是： 操作简单、增代时间短、价格低廉。 某些蛋白质的表达水平很高缺点:表达多肽分子常不能适当地折叠, 蛋白质常无生物活性。 异体蛋白质，常对细菌有毒性作用. 缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如在蛋白质上加上磷酸根(phosphate)和糖基.枯草杆菌；酵母菌细胞；哺乳动物细胞；昆虫细胞。受体细胞应具备的主要条件是R-M- (限制酶和修饰酶缺陷)。受体菌处于感受态

37. (2)．转化(transformation)： 以质粒DNA为载体构成的DNA重组体转入受体细胞的方式称转化。 制备感受态细胞（competent cell）：取对数生长期菌细胞，用CaCl2(冰冷)处理，使其易于接受外源DNA。 感受态菌与重组DNA混合放冰浴40分钟；42℃热休克2分钟；(如用AP平板培养基筛选，需37℃培养1小时)；涂到含有抗生素的平校培养基上，37℃培养过夜。

38. (3)转染(trasfection) 以噬菌体或病毒为载体构建的DNA重组体导入受体细胞的方式称转染。 选用受体细胞不同，转染方式不同。若以大肠杆菌为受体菌转染重组噬菌体DNA时，需要用噬菌体的包装蛋白进行体外包装，形成有感染性的噬菌体颗粒，才能感染大肠杆菌受体细胞。以哺乳动物细胞做受体细胞时用磷酸钙转染技术和电穿孔（electroportion）转染技术直接转染重组体DNA。

39. （五）克隆株的筛选与鉴定1.根据重组体的表型筛选抗性基因插入失活（负性选择法）pBR322； 显色平板筛选法：如pUC19做载体(α-互补）.LacZ-受体菌－编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）片断pUC载体－编码β-半乳糖苷酶氨基端（N端）的α肽 转化菌株 含APr,X-gal和IPTG培养基 菌落颜色pUC19 rDNA Z基因失活、不表达β一半 无色(白颜色)乳糖苷酶、X—gal不被分解pUC19DNA Z基因表达β一半乳糖苷酶 蓝色(自身环化）

40. LacZ o p APr

41. 2.检测目的基因（1）质粒DNA图谱或指纹图谱法(fingerprint）2.检测目的基因（1）质粒DNA图谱或指纹图谱法(fingerprint） 提取质粒DNA直接电泳或用相应的内切酶消化后电泳，根据电泳带的数目、分子量大小分析确定。 (2) PCR方法：提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应电泳带。 （3）核酸杂交法(nucleic acid hybridization)：用已知的特异DNA探针（probe）与变性重组质粒DNA杂交。

42. fig 2 .P1.fingerpringt map of recombination plasmid 1. Molecular Standard (SPP1 DNA/ EcoR1) 2. pUC19 plasmid DNA digested with Sal I and EcoR1 3. pUC19 plasmid DNA 4. Recombination plasmid DNA digested with Sal I and EcoR1 5. Recombination plasmid DNA

43. 3.目的基因表达产物的筛选与鉴定表型筛选法－当外援基因携带遗传标记转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失标记表形。遗传互补法－使用受体菌是营养缺陷型,培养基是基础培养基,当目的基因在受体菌内表达时,受体菌的营养缺陷被纠正,因而在基础培养基上能生长.免疫化学法－该方法是用已知的抗体检查克隆菌株目的基因表达的蛋白抗原。如 Western blot印迹杂交法：提取克隆菌株菌体蛋白→SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳→转印NC膜→特异抗体→酶标抗抗体 →酶底物→观察特异显色带。。

44. 噬菌斑形成筛选法－当噬菌体载体包装外援重组DNA即可形成活性噬菌体克力在培养板上形成噬斑，借此可以初筛。利用报告基因筛选转化细胞－ 用融合基因顺时表达系统将报告基因置于顺式调控因子下游，据报告基因活性衡量顺式调控因子的转录能力