Dr. Julio César Marín Leal ( Profesor )

1. UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERÍA DOCTORADO EN INGENIERÍA AMBIENTAL TÓPICO ESPECIAL DOCTORAL: ECOTOXICOLOGÍA ACUÁTICA Tema 9. Ensayos ecotoxicológicos Dr. Julio César Marín Leal (Profesor) Maracaibo, 2013

2. Bioensayos de toxicidad En términos generales, un bioensayo de toxicidad es una prueba para establecer la naturaleza y la magnitud del efecto que producirá un agente dado cuando los organismos o sistemas biológicos son expuestos a él (Díaz-Báez y col., 2004). Para el caso específico de la ecotoxicología, dichos agentes incluyen muestras ambientales de agua, suelo o sedimentos, efluentes domésticos e industriales, extractos de sedimentos o suelos contaminados, etc.

3. Bioensayos de toxicidad Los bioensayos de toxicidad permiten medir las respuestas de los organismos ante los contaminantes y complementan los análisis fisicoquímicos convencionales para tener una visión integral de los daños que se ocasionan sobre los ecosistemas, adicionalmente se pueden utilizar como instrumentos de control para la descargas de sustancias tóxicas en los cuerpos de agua o en el ambiente en general (Ramírez y col., 2007).

4. Bioensayos de toxicidad Un ensayo de toxicidad es un método que permite evaluar el potencial tóxico de una sustancia sobre un organismo vivo. Estos ensayos son útiles para identificar el efecto que diferentes concentraciones de un contaminante específico puedan tener sobre las especies presentes en un ecosistema. Entre estas sustancias químicas se pueden citar plaguicidas, detergentes y metales pesados usados en diversas actividades humanas, vertidos al suelo o directamente a los cuerpos de agua.

5. Bioensayos de toxicidad En la evaluación de la contaminación acuática los bioensayos de toxicidad son necesarias, debido a que las pruebas fisicoquímicas no resultan suficientes para la valoración de los potenciales efectos sobre los organismos en diversos ecosistemas, no siendo posible determinar, por ejemplo, la interacción de los factores químicos y los efectos tóxicos de los contaminantes. Por lo tanto, un ensayo de toxicidad es una herramienta complementaria que permite detectar y evaluar la capacidad inherente de un agente de producir efectos tóxicos sobre organismos vivos utilizando especies de prueba.

6. El organismo de prueba: criterios para su selección. La selección de especies para la realización de bioensayos se debe hacer de forma cuidadosa. Por esto es necesario tener en cuenta varios parámetros o requisitos que se deben cumplir para alcanzar los resultados esperados. Lo primero es definir los objetivos de la prueba, para lo cual los organismos deben cumplir ciertos requisitos:

7. El organismo de prueba: criterios para su selección. • 1. Disponibilidad de las especies en número y facilidad de recolección. 2. Capacidad de vivir en el laboratorio. • 3. Reproducción en el laboratorio. • 4. Distribución amplia en el área que se desea estudiar. • 5. Conocimiento de la biología del organismo (forma de reproducción, comportamiento y ciclo de vida). • 6. Conocimiento de los requerimientos nutricionales y ambientales (hábitos alimenticios, pH, temperatura, oxígeno disuelto, luz entre otros). • 7. Organismos en buen estado de salud. • 8. Edad y tamaño apropiados. • 9. Alta vulnerabilidad a sustancias tóxicas. • 10. Bajo costo.

8. Tabla 1. Organismos recomendados para pruebas de toxicidad acuática WHO/OMS: Organización Mundial de la Salud OECD: Organization Economic Cooperation and Development USEPA: U. S. Environmental Protection Agency ASTM: American Society for Testing Materials FAO: Food and Agriculture Organization ISO: International Organization for Standarization APHA: American Public Health Association

9. Modelos de ensayos ecotoxicológicos • De Laboratorio: Reproducción parcial de las condiciones reales del ambiente • De Campo: Organismos mantenidos en contenedores adecuados, sometidos a las condiciones del medio.

10. Modelos de ensayos ecotoxicológicos Los bioensayos de laboratorio pueden ser mono o multiespecíficos. Los monoespecíficos están diseñados para obtener información acerca de los efectos de la calidad de agua sobre la supervivencia y sobre aspectos de la estructura y dinámica de una población dada. Los multiespecíficos pueden ofrecer información sobre el impacto a nivel de una comunidad determinada (Tortorelli y Hernández, 1995).

11. Modelos de ensayos ecotoxicológicos • Microcosmos y mesocosmos Poblaciones o comunidades modelo se pueden establecer en el laboratorio o en el campo, que simula pero no reproduce exactamente “el mundo real”. Pueden ser utilizadas para ejecutar experimentos controlados con la réplica adecuada y pueden demostrar los efectos de los productos químicos en los procesos ecológicos, tales como los ciclos de carbono y nitrógeno. El principal problema es la interpretación de los datos procedentes de ellos y relacionarlo con "el mundo real".

12. Tipos de ensayossegún el tiempo de exposición 1. Bioensayo a corto plazo o de toxicidad aguda Es aquel en el que el tiempo de exposición de los organismos de prueba al tóxico es corto – puede ser de minutos, horas o pocos días -, pero por lo general está estandarizado a un periodo de 48 a 96 h. El criterio que generalmente se utiliza para evaluar la toxicidad es la muerte del organismo, aunque algunas veces se evalúan, además de los efectos letales, los subletales.

13. Tipos de ensayossegún el tiempo de exposición 2. Bioensayo detoxicidad subcrónica Experimentación animal para estudiar los efectos producidos por una sustancia cuando se administra repetida o continuamente durante 90 días (WHO, 1979). • Actualmente se considera que el período de exposición cubre, al menos, el 10% del tiempo de generación del organismo de prueba

14. Tipos de ensayossegún el tiempo de exposición 3. Bioensayo a largo plazo o de toxicidad crónica Es aquel en el que el tiempo de exposición de los organismos de prueba al tóxico es largo, superior a 7 días; puede extenderse varios meses, dependiendo del organismo que se utilice, de su ciclo de vida y de los datos que se deseen obtener (UNal, 1996). El criterio para evaluar la toxicidad puede ser también la muerte, pero generalmente se evalúa el efecto subletal, el cual se define como el efecto producido por debajo del nivel que causa la muerte directamente.

15. Bioensayo de reproducción • Bioensayo en el que el período de exposición cubre, al menos, tres generaciones del organismo de prueba

16. Bioensayo de bioacumulación Este tipo de ensayo permite medir la cantidad de tóxico acumulado en el organismo durante la realización del bioensayo; se debe hacer un análisis del organismo completo o de sus órganos por separado, de acuerdo con el tamaño del espécimen de prueba (UNal, 1996). Las sustancias tóxicas que más se analizan son los metales pesados, los pesticidas y los hidrocarburos. Este bioensayo se puede llevar a nivel de biomagnificación, analizando la acumulación del tóxico en la cadena alimentaria.

17. Bioensayo de recuperación • Es un tipo de bioensayo en el que el período de exposición es seguido por la transferencia y observación en un medio no tóxico.

18. Bioensayos para valoración y administración de efluentes industriales Los bioensayos son herramientas adecuadas para evaluar los efectos tóxicos de mezclas complejas como son las descargas de aguas residuales industriales (Schmit, 2005). El análisis de toxicidad permite identificar criterios para el control de los efluentes de plantas de tratamiento de dichas aguas residuales, debido a que las pruebas fisicoquímicas no resultan suficientes para valorar los efectos potenciales sobre la biota acuática y terrestre de las aguas residuales provenientes de efluentes industriales (Eckenfelder, 2000).

19. Bioensayos para valoración y administración de efluentes industriales • 1. Ensayos de toxicidad con efluentes Se realizan para determinar la calidad toxicológica de un efluente de vertimiento constante o variable. El agua residual se toma continuamente de una conducción de descarga perforada en un punto apropiado, de modo que las diluciones de ensayo se reemplacen también continuamente, con diluciones del efluente análogas a las que se descargan en el momento. En estos bioensayos las diluciones permanecen inalteradas, pero la toxicidad de cada dilución examinada fluctúa a lo largo del ensayo paralelamente a las fluctuaciones en la calidad del efluente.

20. Bioensayos para valoración y administración de efluentes industriales • Ensayos de toxicidad de alarma en efluentes. Estos se realizan en el sitio de descarga y permiten determinar si las aguas receptoras del vertimiento o de otros contaminantes producen una respuesta medible, que por lo general es la muerte de los organismos de ensayo. Estos se exponen experimentalmente a la acción de las aguas del caso en jaulas u otro tipo de recipientes, o en acuarios, en que se bombea el agua. Estos ensayos se pueden hacer a distintas distancias de un desagüe, donde las aguas residuales se han diluido y naturalmente envejecido en grados diversos. A este también se le denomina bioensayo in situ

21. Métodos alternativos al uso de animales de experimentación La palabra “alternativa” no está específicamente definida en el mundo de la experimentación animal; sin embargo ha sido necesario que los investigadores comprendan su significado en dicho ámbito. La definición comúnmente aceptada es la que considera como técnicas alternativas aquellos métodos o modelos que: 1) incorporan un refinamientode los procedimientos, de modo que disminuyen el dolor o malestar de los animales, o bien aumentan su bienestar; 2) permiten una reducciónen el número de animales necesario; 3) facilitan el reemplazodel uso de animales por sistemas que no requieren seres vivos, o bien se emplean otras especies animales que sean inferiores en la escala filogenética animal. Debido a que los tres objetivos a alcanzar con los métodos alternativos empiezan con la misma consonante, se las denomina las 3 R.

22. Bioensayos de toxicidad con invertebrados Los invertebrados son los organismos más comúnmente utilizados en las pruebas de toxicidad y sólo se utiliza con frecuencia aquellos aprobados por la mayoría de las organizaciones internacionales como la EPA de los EE.UU., la OCDE y la ISO. Las pruebas con los invertebrados acuáticos se pueden dividir entre las pruebas de agua y pruebas de sedimentos y de ensayo con agua dulce y marina (Smutná, 2007).

23. Bioensayos de toxicidad con invertebrados En ecosistemas acuáticos, un grupo de invertebrados de importancia es el zooplancton que constituye la fauna herbívora y está conformado básicamente por pequeños crustáceos nadadores, como rotíferos, cladóceros y copépodos. El zooplancton, a su vez, es el alimento de consumidores secundarios y de peces. A continuación se describe en forma breve cada uno de estos subgrupos.

24. Bioensayos de toxicidad con invertebrados • Rotíferos Los rotíferos pueden cultivarse fácilmente en el laboratorio aunque no han sido ampliamente utilizados, debido a su pequeño tamaño. Sin embargo, recientemente se ha desarrollado una prueba que permite la eclosión de los organismos de prueba a partir de huevos y se realiza la evaluación de la toxicidad en forma rápida. Esta prueba no ha sido usada de manera extensiva.

25. Bioensayos de toxicidad con invertebrados • Cladóceros Dentro del grupo de cladóceros, las especies del genero Daphniason las mas utilizadas como organismo de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia distribución geográfica, el importante papel que cumplen en la comunidad zooplanctónica y en el ecosistema acuático responsable por la transferencia de energía de un nivel a otro de la cadena trófica., la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción partenogénica (lo cual asegura una uniformidad de respuesta) y el corto ciclo de vida con la producción de un alto número de crías, han hecho a este grupo ideal para la evaluación de toxicidad en muchos países.

26. Bioensayos de toxicidad con invertebrados • Copépodos y camarones Los copépodos se han utilizado extensamente, y existen procedimientos y métodos de cultivo para varias especies. Tienen reproducción sexual por lo que requiere de machos y hembras. Debido a que nadan con rapidez su captura es difícil, lo cual ha limitado su uso como organismo de prueba.

27. Bioensayos de toxicidad con invertebrados • Copépodos y camarones Los camarones, particularmente algunas especies de agua salada y de estuarios tales como Mysidopsissp., han sido utilizado de manera extensiva en pruebas agudas. Pueden ser cultivados en el laboratorio o recolectado en el campo, por lo general, en las aéreas costeras; los adultos se mantienen en tanques, y los recién nacidos y las hembras con huevos se usan directamente. Los camarones tienen reproducción sexual y por lo tanto los métodos de cultivo son algo mas complicado que para los cladóceros. Los protocolos para pruebas agudas con Mysidopsissp. Se pueden adaptar a otras especies. A pesar que existen metodología de cultivos para otras especies, el género Mysidopsis es el mas utilizado (USEPA, 1994).

28. Bioensayos de toxicidad con invertebrados Insectos, nematodos, moluscos y crustáceos • Estos grupos de animales son utilizados en pruebas con sedimentos, ya que la mayoría de las especies usadas son predominantes bentónicas. En general, existe suficiente información sobre los cultivos de muchos de ellos aunque el número de protocolos es más limitado. Los organismos se obtienen principalmente en el campo, dada su capacidad para soportar los riesgos de la recolección y la transferencia al laboratorio.

29. Bioensayos de toxicidad con peces Los peces, considerados por muchos toxicólogos como los organismos de pruebas mas apropiados por su directa relación con los seres humanos permiten análisis biológicos detallados de histología y patología. Como son consumidos directamente por los seres humanos, la información sobre el efecto o concentración de las sustancias tóxicas en sus tejidos es un componente importante en un programa toxicológico. Existen muchos protocolos de pruebas, en los cuales se incluyen procedimientos para diferentes etapas del ciclo de vida (primera edad, huevos, larvas, alevinos), así como para el crecimiento y la reproducción.

30. Bioensayos de toxicidad con peces Unas de las ventajas de este organismo es que constituye un nivel alto de la cadena trófica y por tanto los resultados dan una predicción directa sobre la salud de una comunidad acuática. Los estudios con peces permiten realizar estudios toxicológicos complejos, por lo que la información generada con estos organismos incluye aspectos como química sanguínea, efectos sobres tejidos corporales y órganos. Desafortunadamente, las pruebas requieren una infraestructura costosa, laboratorios con temperaturas controladas y un abastecimiento grande de agua, además un conocimiento profundo de las técnicas de cultivo y de pruebas.

31. Bioensayos de toxicidad con peces El tiempo requerido para los estudios de ciclos de vida, reproducción y crecimiento ha limitado este tipo de ensayos. Actualmente, se utilizan larvas de siete días de edad, con las cuales pueden obtener datos crónicos en un corto periodo de tiempo (USEPA, 1994).

32. Bioensayos para evaluar la toxicidad del sedimento Debido a que el sedimento puede ser tóxico, existen necesidades legales y regulatorias para determinar si sedimentos específicos son tóxicos. Existe en general una necesidad para entender como la toxicidad en sedimentos está contribuyendo a la degradación de los recursos acuáticos; desde hace tiempo las agencias regulatorias han reconocido la importancia de entender la toxicidad de los sedimentos. Ya en el 1977 se publicaron directrices para la evaluación caso a caso de la toxicidad de materiales dragados que se desechan en los océanos (US EPA, 1977). En la actualidad muchos países, están considerando los criterios para regular las concentraciones de contaminantes específicos en sedimentos y evaluar los sedimentos contaminados (Melzian, 1990; Casado-Martínez y col., 2006a).

33. Bioensayos para evaluar la toxicidad del sedimento Los bioensayos con sedimento son usualmente, exámenes relativamente simples que evalúan la respuesta de los organismos de prueba en un sedimento contaminado bajo condiciones controladas. Sus ventajas potenciales han sido citadas por numerosos autores (Chapman & Long, 1983, Hair, 1986; Swartz, 1987; Chapman, 2007). La mayoría de los bioensayos son menos costosos y consumen menos tiempo que los estudios ecológicos. Empíricamente los bioensayos se dirigen a los problemas de interacciones de mezclas de contaminantes (Chapman, 1989) y miden directamente una respuesta biológica de la contaminación en una muestra de sedimento.

34. Referencias bibliográficas • Casado-Martínez. M., Buceta. J., Forja. J. and DelValls T. (2006a). Ejercicio interlaboratorio de bioensayos marinos para la evaluación de la calidad ambiental de sedimentos costeros. I. descripción del ejercicio y calidad de los sedimentos. Ciencias Marinas. 32 (1), 121 – 128 • Díaz – Báez. M., Bustos. M. y Espinosa. A. (2004). Pruebas de toxicidad acuática: fundamentos y métodos. Universidad Nacional de Colombia (Sede Bogotá). ISBN: 958-701-385-9. 120pp. • Melzian. B. (1990). Toxicity assessment of dredged materials: Acute and chronic toxicity as determined by bioassays and bioaccumulation tests. In: Proceedings of the Int. Seminar on the Environmental Aspects of Dredging Activities (Eds C. Alzieu & B. Gallenne), pp.49- 64. Nantes, France. • Ramírez. P., Pica. Y. y Martínez. F. (2007). Pruebas biológicas para la evaluación Ecotoxicológica de las sustancias químicas. Tercera etapa: Desarrollo de pruebas biológicas con especies Nativas y ejercicio de intercalibración. México. 342 p. • Smutná. M. (2007). Experimental models of chronic ecotoxicity with aquatic invertebrates. Dissertation thesis in environmental chemistry No. 37. Masaryk University, Faculty of Science, Recetox - Research Centre for Environmental Chemistry and Ecotoxicology Brno, Czech Republic. 112 p.

35. Referencias bibliográficas • Universidad Nacional de Colombia (UNal). (1996). Ensayos de toxicidad y su aplicación al control de la contaminación industrial. Unidad de educación continuada. • United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1994). "Short-Tem Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Efluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms". Ed. USEPA/6OO, Third Edition. Washington DC, USA. págs 4 - 91. • US Environmental Protection Agency (EPA). US Army Corps of Engineers Technical Committee on Criteria for Dredged and Fill Material (1977) Ecological Evaluation of Proposed Discharge of Dredged Material into Ocean Waters: Implementation Manual for Section 103 of Public Law 92-532. Environmental Effects Laboratory, US Army Water-ways Experiment Station, Vicksburg, Mississippi. • WHO (1979) "Agreed Terms on Health Effects Evaluation and Risk and Hazard Assessment of Environmental Agents", Internal Report of a Working Group, (EHE/EHC/79.19), World Health Organization, Geneva.

36. Gracias por su atención