Dr. Julio César Marín Leal (Profesor)

1. UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERÍA DOCTORADO EN INGENIERÍA AMBIENTAL TÓPICO ESPECIAL DOCTORAL: ECOTOXICOLOGÍA ACUÁTICA Tema 2. Toxicidad aguda y crónica. Dr. Julio César Marín Leal (Profesor) Maracaibo, 2013

2. Principios generales Latoxicidad aguda se refiere al desarrollo rápido de síntomas y efectos después de la aplicación de una dosis única relativamente alta o comúnmente se relaciona con los daños inmediatos generados por dosis únicas suficientemente grandes. Por esto difiere de la toxicidad crónica que describe la acción tóxica de la sustancia en exposiciones repetidas en un periodo de tiempo más largo (meses a años).

3. Métodos de ensayo de toxicidad, aguda y crónica Ensayo Simple Las pruebas de toxicidad, tanto agudas como crónicas, se llevan a cabo frecuentemente en especies aisladas y se realizan con unos o pocos agentes tóxicos, aunque su propósito sea la protección de los seres vivos en los sistemas naturales. Asimismo, son escasos los estudios que consideran las condiciones optimas del medio para una especie de prueba, como la temperatura, la salinidad, la concentración del oxígeno disuelto en el agua, la luz y el pH. Dichas variables afectan tanto el comportamiento del espécimen en función de la estacionalidad, como la toxicidad del contaminante.

4. Métodos de ensayo de toxicidad, aguda y crónica Ensayos multiespecie Como su nombre lo indica son pruebas que incluyen más de una especie, realizadas con el fin de evaluar las alteraciones producidas por interacciones entre organismos y por la influencia del medio ambiente. Acorde a la cantidad de variables incluidas dentro del ensayo estos se pueden clasificar, tal como los describe Landis & Yu (2003), en: • Microcosmos • Mesocosmos • Estudios en campo

5. Métodos de ensayo de toxicidad, aguda y crónica Ensayos multiespecie • Microcosmos: Incluye un número reducido de especies, usualmente mide interacciones predador-presa o de competencia y se instala en condiciones de laboratorio. • Mesocosmos: Evalúa una mayor cantidad de especies y por ende interacciones más complejas, como cadenas tróficas, por lo general se instala en condiciones externas, es decir incluye variaciones climáticas. • Estudios en campo: Pueden ser experimentales u observacionales, incluye todos los niveles de organización biológica y la totalidad de variables temporales, climáticas y espaciales que conforman los ecosistemas, características que hacen que este nivel de estudio sea difícil, costoso y controversial si se hace a nivel experimental, pero que al mismo tiempo lo constituye en la evaluación más exacta de los efectos generados por un agente en el ambiente.

6. Figura 1. Clasificación de los bioensayos

7. Pruebas de toxicidad para peces

8. Ecotoxicidad-Prueba de toxicidad aguda para peces de agua dulce con Brachydaniorerio - Metodo estático (Fishacutetoxicity test)(ISO 7346-1). Esta prueba puede realizarse ajustándose en las especificaciones a cualquiera de las siguientes directrices: ISO 7346-1: 1996; Procedimiento OECD 203; EPA-OPPTS-850-1075; RD 363/1995 de 10 de marzo anexo V; Directrices EU 92/69 EEC (O.J. L383 A). Esta prueba determina el efecto tóxico de una sustancia para peces. Para ello se utiliza la especie Brachidaniorerio (pez cebra) que se expone a la sustancia de ensayo durante 96 horas, registrándose la mortalidad a las 24, 48, 72 y 96 h, y determinándose las concentraciones que matan al 50% (LC50).

9. Ecotoxicidad-Prueba de toxicidad aguda para peces de agua dulce con Brachydaniorerio - Metodo estático (Fishacutetoxicity test)(ISO 7346-1). La prueba se desarrolla en dos fases: en una fase preliminar se determina la concentración media letal aguda aproximada, y en la segunda fase se determina la concentración letal aguda utilizando un rango de concentraciones ajustado que debe incluir la concentración superior que mate a todos los peces y la concentración inferior no letal en 96 h, de forma que se pueda obtener la concentración que mata entre el 0 y 100% de los peces para determinar la LC50. Cuando se utilizan sustancias químicas puras debe determinarse su concentración a lo largo de las pruebas.

10. Ecotoxicidad-Prueba de toxicidad aguda para peces de agua dulce con Brachydaniorerio - Metodo estático (Fishacutetoxicity test)(ISO 7346-1). En la prueba se utilizan ejemplares deBrachidaniorerio (pez cebra) de unos 30 mm que se aclimatan durante 7 días en el agua de dilución especialmente preparada para el ensayo con unas sales incorporadas, y en ella debe medirse a lo largo del ensayo diariamente, la concentración de oxígeno disuelto, la temperatura, y el pH. Las sustancias a probar se disuelven en agua de dilución. Las pruebas se realizan en recipientes de 10 litros utilizándose 6 recipientes con 3 peces como mínimo en el ensayo preliminar, y otros 6 con al menos 7 peces en el ensayo definitivo por lo que como mínimo se utilizan 60 peces. Además debe incluirse un control positivo constituido por dicromato potásico.

11. Tabla 1. Condiciones recomendada para la prueba de toxicidad aguda con larvas y juveniles de Brachydaniorerio y Poecillareticulata Fuente: Martínez y Espinosa, 2008

12. Pruebas de toxicidad con microalgas

13. Ecotoxicidad-Inhibición del crecimiento de algas con algas verdes unicelulares (ISO 8692) Esta prueba puede realizarse ajustándose en las especificaciones a cualquiera de las siguientes referencias ISO 8692: 2004 (E); RD 363/1995 de 10 de marzo anexo V; Procedimiento OCDE 201; Directrices EU 92/69 EEC (O.J. L383 A) y/o  EPA-OPPTS 850.5400. 

14. Ecotoxicidad-Inhibición del crecimiento de algas con algas verdes unicelulares (ISO 8692) En esta prueba se exponen cultivos de algas verdes unicelulares seleccionadas en fase exponencial de crecimiento a diversas concentraciones de la sustancia de ensayo bajo las condiciones definidas por la prueba. Las soluciones de ensayo con algas se incuban durante un período de 72 h, durante el cual se mide la densidad celular en cada una de ellas al menos cada 24 h y se determina la inhibición del crecimiento en relación a un cultivo control. 

15. Ecotoxicidad-Inhibición del crecimiento de algas con algas verdes unicelulares (ISO 8692) Esta prueba se realiza con unas algas microscópicas de agua dulce, utilizando en nuestro laboratorio las cepas recomendadas por las normas citadas: Pseudokirchneriellasubcapitata (= Selenastrumcapricornutum) yDesmodesmussubspicatus (= Scenedesmussubspicatus). Así mismo, pueden utilizarse algas microscópicas marinas (Skeletonemacostatum) en caso de que el cliente lo solicite. Como sustancia control positivo utilizamos una solución de dicromato potásico, a menos que alguna normativa o el cliente indiquen el uso de otra sustancia.

16. Tabla 2. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad crónica con microalgas clorofíceas Fuente: Martínez, 2008

17. Pruebas de toxicidad con cladóceros

18. Tabla 3. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda con cladóceros

19. Ecotoxicidad-Prueba de inhibición de la movilidad con Daphnia magna (Daphnia magnaAcuteToxicity Test)(ISO 6341). Esta prueba puede realizarse ajustándose en las especificaciones a cualquiera de las siguientes directrices: ISO 6341: 1996; Procedimiento OECD 202; EPA-OPPTS-850-1010; RD 363/1995 de 10 de marzo anexo V; Directrices EU 92/69 EEC (O.J. L383 A).

20. Ecotoxicidad-Prueba de inhibición de la movilidad con Daphnia magna (Daphnia magnaAcuteToxicity Test)(ISO 6341). En esta prueba se determina la toxicidad aguda para Daphnia magna que pueden tener sustancias químicas solubles o sustancias químicas que puedan mantenerse en una suspensión estable o en dispersión. Así mismo, puede realizarse con efluentes industriales o residuales, tratados o sin tratar después de su decantación, filtración o centrifugación, con aguas superficiales o con aguas subterráneas. La prueba determina la concentración que a las 24 h inmoviliza el 50% de las daphnias expuestas proporcionando el parámetro EC50i-24 h, y cuando sea requerido la inmovilización a las 48 h (EC50i-48 h). 

21. Ecotoxicidad-Prueba de inhibición de la movilidad con Daphnia magna (Daphnia magnaAcuteToxicity Test)(ISO 6341). La prueba se realiza en dos fases: en una primera fase se determina el rango de concentraciones a probar de una solución stock de una sustancia, de un efluente, etc.; en la segunda fase, ensayo definitivo, se calculan las concentraciones que inmovilizan al menos a 3 porcentajes entre el 10 y 90%. Todos los ensayos se realizan siempre por  cuadruplicado requiriéndose entre los ensayos preliminares y el definitivo, incluyendo los controles positivos y negativos, unos 400 ejemplares de Daphnia magna. Durante la prueba debe medirse la concentración de oxígeno disuelto y pH. Debe proporcionarse, a ser posible, el método para cuantificar la sustancia química a ensayar  cuando se trate de ellas.

22. Análisis estadísticos La gran cantidad de información que es posible generar en la actualidad a partir de un sistema experimental o de la naturaleza misma, gracias a la capacidad de los laboratorios analíticos y a los sistemas computarizados de adquisición de información, hace que el científico se encuentre a menudo, con un número enorme de datos a partir de los cuales debe sacar conclusiones (Serrano, 2010).

23. Análisis estadísticos La estadística aplicada a las diferentes ramas de las ciencias experimentales se ocupa de desarrollar métodos que permiten a los investigadores y científicos el tratamiento de estos datos. Así, el uso de las herramientas estadísticas a nuestra disposición permite extraer la máxima cantidad de información relevante contenida en un conjunto de datos obtenidos a lo largo de un experimento. Además, la implantación generalizada de los ordenadores en los centros de investigación hace que, en la actualidad, la aplicación de los métodos estadísticos sea extremadamente fácil (Serrano, 2010).

24. Factores que modifican la toxicidad La magnitud de la respuesta tóxica en un organismo determinado depende de la exposición (dosis, tiempo, ruta y vía de exposición) y de factores relacionados con las características del organismo expuesto, del medio ambiente y de la sustancia misma.

25. Factores que modifican la toxicidad Los factores que modifican la toxicidad de un producto pueden esquematizarse de la siguiente forma: • Factores que dependen del tóxico: Composición del agente químico, propiedades fisicoquímicas, dosis y concentración, rutas de administración, metabolismo del agente tóxico. • Factores que dependen del individuo: Estado de salud, edad y madurez, estado nutricional y factores dietéticos, sexo, genética. • Factores que dependen del ambiente: Temperatura, presión atmosférica, actividad lumínica, ocupación.

26. Factores que modifican la toxicidad La intensidad de toda reacción químico-biológica, y por tanto tóxica depende de: 1. La capacidad del producto de atravesar las barreras biológicas y llegar a su lugar de acción. 2. la dosis de producto activo que se encuentra en el sitio de acción. 3. las condiciones de este sitio de acción (receptor, enzima, transportador). Estas circunstancias son función de: 1. factores que dependen del medio ambiente. 2. factores endógenos propios del individuo. 3. inducción o antagonismo por otros productos.

27. Factores que modifican la toxicidad

28. Referencias bibliográficas • Landis, W. G & Yu M. (2003). Introduction to environmental toxicology: Impacts of chemicals upon ecological systems (3a Ed.). Florida: Lewis Publishers. • Martínez-Jerónimo. F. y Espinoza-Chávez. F. (2008). Ensayo de toxicidad aguda con larvas y juveniles de los peces Brachydaniorerio y Poeciliareticulata. Pp. 115 - 126 in Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México (P. Ramírez Romero y A. Mendoza Cantú Compiladoras). Instituto Nacional de Ecología, Semarnat. • Martínez-Jerónimo. F. (2008a). Ensayo de toxicidad crónica con microalgas clorofíceas. Pp. 89 – 98 in Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México (P. Ramírez Romero y A. Mendoza Cantú Compiladoras). Instituto Nacional de Ecología, Semarnat • Martínez-Jerónimo. F. (2008b). Ensayo de toxicidad aguda con cladóceros de la familia Daphnidae. En: Ramírez-Romero, P. y A. Mendoza-Cantú (compiladoras). Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (Semarnat), México, págs. 99-113. • Serrano. R. Introducción al análisis de datos experimentales. Tratamiento de datos en bioensayos. Universitat Jaume I. España. 2010. 187 p

29. Gracias por su atención