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Marcatori Molecolari

Marcatori Molecolari. Introduzione Marcatori proteici DNA Marcatori RFLP PCR. Marcatori RAPD Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi Considerazioni. Applicazioni. Introduzione. I fattori ambientali possono influenzare i caratteri morfologici

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Presentation Transcript

  1. Marcatori Molecolari • Introduzione • Marcatori proteici • DNA • Marcatori RFLP • PCR • Marcatori RAPD • Marcatori STS • Marcatori AFLP • Tecniche elettroforesi • Considerazioni • Applicazioni

  2. Introduzione • I fattori ambientali possono influenzare i caratteri morfologici • I marcatori molecolari (MM) focalizzano la diversità del materiale genetico e misurano le variazioni controllate da geni • I MM possono essere usati per : • misurare diversità genetica • costituire mappe genetiche • selezione assistita (MAS) • supporto all’isolamento genico (PC) Che cosa sono i Marcatori Molecolari ?? • Marcatori Molecolari • sequenze proteiche e di DNA facilmente individuabili e la cui eredità può essere controllata • Polimorfismo in proteine • proteine del seme • isoenzimi ed alloenzimi • Polimorfismi di DNA • nucleare • citoplasmatico

  3. Proprietà desiderabili • Polimorfico • Eredità codominante • Distribuito in tutto il genoma • Facile e veloce da individuare • Poco costoso • Riproducibile / Trasferibile • Nessun marcatore le possiede tutte Marcatori proteici • Breve introduzione alle proteine • Proteine di conservazione del seme • Isoenzimi • Alloenzimi

  4. Struttura delle proteine Struttura delle proteine • Struttura primaria – backbone del polipeptide • Struttura secondaria – legami ad idrogeno locali • Struttura terziaria – legami che coinvogono i gruppi R • Struttura quaternaria – interazione tra polipeptidi

  5. Proteine seed storage Proteine ed ambiente • La struttura tridimensionale delle proteine è il risultato dell’interazione con l’ambiente. • Bisogna quindi tenere conto della denaturazione delle proteine …. • …. e della diversità della loro funzione … • …facilitata dalla complessità di struttura • Perché usiamo le proteine del seme ?? • i semi sono ricchi di proteine • le proteine sono disponibili in sufficiente quantità • i semi sono uno stadio dello sviluppo ben definito • La metodologia • si estraggono le proteine e si separano in elettroforesi • si visualizzano sul gel con la colorazione (staining) • si analizza il pattern delle bande

  6. Considerazioni ed Applicazioni • Considerazioni • co-migrazione • pattern delle bande complesso • variazione intraspecifica • Applicazione della tecnica • es. frumento, orzo • recentemente anche melanzana Isoenzimi ed Alloenzimi • Forme multiple dello stesso enzima • isoenzima : un enzima, più di un locus genico • alloenzima : un enzima, un locus genico • Metodologie • tessuti macerati • enzimi separati per elettroforesi • visualizzazione per colorazione istochimica • analisi del pattern

  7. Interpretazione del pattern • Omozigote o eterozigote ?? • Struttura quaternaria dell’enzima • Numero di loci • Numero di alleli • Analisi genetiche spesso necessarie Formazioni di eteromeri

  8. Applicazioni • Metodo potente e riproducibile per : • caratterizzare/identificare genotipi • studi di genetica di popolazione • esaminare patterns di variazione geografica • Limitato numero di enzimi disponibili Marcatori su DNA • Le basi del DNA • Metodo RFLP • Metodi basati sulla PCR • Marcatori STS • Marcatori AFLP • Tecniche elettroforesi

  9. Le basi del DNA La sintesi del DNA

  10. Marcatori RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism • Gli RFLP esaminano differenze in peso mole-colare di specifici frammenti di DNA ristretti • Usualmente si utilizza il DNA totale • Richiedono DNA puro e di alto peso molecolare Metodologia RFLP • Tagliare il DNA in piccoli frammenti • Separare i frammenti in gel eletttroforesi • Trasferire i frammenti di DNA su filtro

  11. Metodologia RFLP • Visualizzazione dei frammenti di DNA • sonde radioattive • sonde non-radioattive • Analisi dei risultati • bande selezionate per presenza/assenza • differenze nel pattern riflettono differenze genetiche • La scelta di sonda ed enzima di restrizione è cruciale Interpretazione dei Risultati

  12. Esempio di Analisi RFLP su fragola RFLP : vantaggi e svantaggi • Riproducibili • Marcatori codominanti • Tecnica semplice • Tecnica lunga e costosa • Utilizzo di sonde radioattive

  13. Marcatori su DNA • Le basi del DNA • Metodo RFLP • Metodi basati sulla PCR • Marcatori STS • Marcatori AFLP • Tecniche elettroforesi PCR Polymerase Chain Reaction • Potente tecnica per amplificare il DNA • Prevede l’utilizzo di cicli di temeperature • step di denaturazione • step di annealing • step di elongazione • Il DNA amplificato viene separato su gel elettroforesi

  14. I tre passaggidella PCR PCR : componenti reazione • Utilizzo della Taq polimerasi • Condizioni di reazione • Importanza della standardizzazione • Una reazione contiene : • target DNA • Taq polimerasi • uno o più starter o primer • 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP • buffer di reazione con il cofattore MgCl2

  15. PCR : riassunto • DNA polimerasi • Apparecchio Thermal Cycler • Profilo delle temperatura (programma) • Concentrazione del DNA target • Concentrazione dello ione Mg RAPD Random Amplified Polymorphic DNA • Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando primer arbitrari • Metodo veloce per individuare polimorfismi • Marcatori dominanti • Problemi di riproducibilità

  16. Interpretazione dei RAPDs • I marcatori RAPDs sono anonimi • I marcatori RAPDs sono dominanti • Problemi di co-migrazione • una banda, un frammento ? • stessa banda, stesso frammento ? RFLP : vantaggi e svantaggi • Semplici e veloci • Poco costosi • Non utilizza radioattivo • Marcatori dominanti • Problemi di riproducibilità • Problemi di interpretazione

  17. Marcatori su DNA • Le basi del DNA • Metodo RFLP • Metodi basati sulla PCR • Marcatori STS • Marcatori AFLP • Tecniche elettroforesi STS Sequence-Tagged Sites • Utilizzano la PCR a partire da : • Sequence-Tagged Microsatellites (STMS) • Oligonucleotidi ancorati a MS • inter-simple sequence repeat (ISSR) • Sequence-characterized amplified regions (SCARs) • Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)

  18. Marcatori Microsatelliti • Sequence-Tagged MS • In genere single locus multiallelico • Codominante • Inter-simple sequence repeats • Amplificano segmenti adiacenti sequenze ripetute (repeats) • Marcatori dominanti SCARs and CAPS • SCARs – sequence characterized amplified regions • marcatore single locus derivante da frammento RAPD • CAPS – cleaved amplified polymorphic sequence • Marcatore locus specifico • Prodotto di amplificazione RAPD utilizzato come sonda RFLP

  19. Marcatori su DNA • Le basi del DNA • Metodo RFLP • Metodi basati sulla PCR • Marcatori STS • Marcatori AFLP • Tecniche elettroforesi AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism • Tecnicamente sfruttano la combinazione tra RFLP e PCR • Il risultato è un fingerprint altamente informativo • Il metodo diviene sempre più popolare

  20. AFLP La Tecnica

  21. AFLP : vantaggi e svantaggi • Altamente sensibili • Altamente riproducibili • Largamente applicabili • Costosi • Tecnicamente difficili • Necessari radioisotopi • Problemi di interpretazione Analisi RAPD su melanzana

  22. Esempio di Analisi AFLP su vite

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