MALATTIE GENOMICHE: MECCANISMI MOLECOLARI E CONSEGUENZE FENOTIPICHE

1. MALATTIE GENOMICHE: MECCANISMI MOLECOLARI E CONSEGUENZE FENOTIPICHE Dott.ssa Francesca Amati Sezione di Genetica Dip. Biopatologia e Diagnostica per Immagini Università Tor Vergata Roma

2. Malattie genomiche(Genomic disorders) Questa definizione è stata coniata da Lupski (Trends Genet, 1998) per descrivere la perdita o l’acquisto di una specifica regione cromosomica che si associa tipicamente ad una sindrome genetica.

3. Malattie genomiche (genomic disorders) un gruppo di malattie genetiche umane causate da riarrangiamenti del genoma questi riarrangiamenti coinvolgono segmenti di DNA di dimensioni variabili da poche Kb a parecchie Mb All’interno di questi segmenti si trovano geni dosaggio-sensibili

4. Meccanismi molecolari Tutte le malattie genomiche sono causate da un comune meccanismo molecolare: - ricombinazione omologa non-allelica (NAHR) tra regioni ripetute (segmental duplications o low-copy repeats LCRs) fiancheggianti un segmento genomico unico. - più raramente la causa è una giunzione terminale non omologa (NHEJ)

5. Meccanismi molecolari (Non-allelic homologous recombination ) (Non-homologous end-joining ) Shaw, C. J. et al. Hum. Mol. Genet. 2004

6. Modelli di ricombinazione intercromosomica (1)

7. Modello di ricombinazione intercromosomica (2)

8. LCR (low copy repeats) o duplicazioni segmentali Sono regioni di DNA caratterizzate da sequenze ripetute (sequenze esoniche, pseudogeni, ecc) Le sequenze ripetute all’interno di ogni LCR possono avere uno stesso orientamento (LCR dirette) oppure un orientamento invertito (LCR inverse)

10. Malattie genomiche: meccanismi molecolari Le regioni cromosomiche coinvolte nei riarrangiamenti hanno delle caratteristiche comuni che influenzano la ricombinazione (NAHR). Infatti la ricombinazione tra LCR dirette causa delezioni o duplicazioni La ricombinazione tra LCR inverse causa inversioni

11. LCR Tutte le LCR che sono coinvolte nella patogenesi delle malattie genomiche condividono una notevola identità della sequenza nucleotidica (95-98%) Inoltre studi molecolari dettagliati dimostrano che i breakpoint di ricombinazione sono posizionati in tratti delle LCR che hanno assoluta identità di sequenza nucleotidica Sono generate da duplicazioni segmentali del genoma trasposizione di un frammento genomico da una posizione ad un’altra

12. LCR costituiscono circa il 5% di tutto il genoma umano (dati dal Progetto Genoma) LCR E’ probabile che nel futuro si identifichino altre associazioni tra malattie umane e riarrangiamenti genomici

13. Evoluzione del genoma dei mammiferi Vari studi dimostrano che nei mammiferi inferiori (es: topo) non sono presenti LCRs Le LCRs umane si sono evolute recentemente, e in particolare, dopo la speciazione dei primati

14. Duplicazioni segmentali nel genoma umano

15. Malattie genomiche I riarrangiamenti genomici associati alle malattie genomiche sono: Delezioni Duplicazioni Inversioni

16. Malattie genomiche Le malattie genomiche sono relativamente frequenti: ~1x10 -4 NB Frequenza di mutazioni de novo per caratteri autosomici dominanti è ~1x10 -3

17. Malattie genomiche Le malattie genomiche sono causate da riarrangiamenti di segmenti cromosomici che hanno delle caratteristiche “architettoniche” specifiche → quindi non esistono delle differenze tra le varie popolazioni Come invece è stato osservato per alcune malattie monogeniche come l’anemia falciforme o la fibrosi cistica

18. Malattie genomiche Malattie genomiche sono caratterizzate da un’ampia serie di fenotipi clinici Questi fenotipi sono causati dalla aploinsufficienza di uno o più geni contenuti all’interno delle regioni riarrangiate

19. Duplicazioni segmentali coinvolte nella patogenesi di malattie genomiche

20. Duplicazioni segmentali che causano le malattie genomiche

21. Tecniche di analisi dei riarrangiamenti cromosomici Tecniche di citogenetica classica permettono la visualizzazione di anomalie segmentali che coinvolgono da 2-10 Mb di DNA duplicato o deleto. L’introduzione della citogenetica molecolare (FISH) ha permesso di riconoscere su cromosomi in metafase e su nuclei in interfase microdelezioni e/o microduplicazioni (1-3 Mb). La più recente tecnica dell’array CGH è già ampiamente usata per analisi di riarrangaimenti cromosomici in tumori solidi, ritardi mentali, riarrangaimenti subtelomerici, e anomalie cromosomiche costituzionali. La tecnica MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification) permette la quantificazione relativa di differenti segmenti di DNA genomico (fino a 45 contemporaneamente) basandosi su una singola reazione di PCR quantitativa.

22. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

23. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) • sonde locus-specifiche • sonde painting • sonde alfoidi Sonde locus-specifiche Sonde paintig Sonde alfoidi

24. SINDROME DI DIGEORGE

25. GENES, CHROMOSOMES & CANCER 20:399–407 (1997) aCGH (array-based Comparative Genomic Hybridization) (Modificato da Davies et al., 2005)

26. Analisi di aCGH Analisi di aCGH Immagini ottenute da analisi con software BluFuse for Microarrays 3.3 (5164) (BluGnome Ltd, Cambridge)