Projet I

1. Projet I Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN

2. Objectifs • Déterminer quel gène vous avez (Bioinfo) • Générer une carte théorique (Bioinfo) • Vérifier expérimentalement la carte • Déterminer l’orientation

3. Cartographie des plasmidesinconnus • Vecteur pUC19

4. Clonagedans pUC19 X SCM Digéré avec X

5. Clonagedans pUC19 Insertion X + X

6. Déterminer le site d’insertion Insertion X + Couper avec X X

7. X Delimites la droite & la gauche Ex. Si Pstest le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xbaest le site d’insertion, alors Bam est à la droite

8. Déterminerl’orientation relative Orientation 1 A X A X Orientation 2 A X A X

9. Projet II Mutagenèse dirigée de LacZ

10. Objectifs • Utiliser le PCR pour faire l’amplification et la mutagenèse du gène LacZ dans pUC19 • Utiliser le PCR pour ajouter des sites de restrictions appropriés aux extrémités du gène LacZ pour permettre le clonage

11. Réplication & Amplification d’ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne

12. Polymérases Amorce Extrémité 3’OH -OH Matrice d’ADN ou ARN Polymérase 5’…GTACT 3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’ TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG

13. 2 Types de Polymérases ADN: • ADN dépendante : • Requiert une matrice ADN • Fait la synthèse d’ADN • Ex. Polymérase Taq • ARN dépendante • Requiert une matrice ARN • Fait la synthèse d’ADN (ADNc) • Ex. Transcriptase inverse

14. La Réaction de la Polymérase en Chaîne-PCR • Réplication répétitive d’une région donnée d’ADN • Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADN • Augmente la représentation relative d’une région d’intérêt • Permet l’isolation d’une région donnée d’ADN 14

15. PCR-1ier Cycle 5’ 3’ 3’ 5’ Dénaturation (95oC) 5’ 3’ 3’ 5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ Appariement des amorces (Tm) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’>

16. 5’ 3’ 3’ 5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ Extension (72oC) <3’GGAACGGTACCGT5’ --------------------------------  ----------------------------------  5’CCGTGGGGT3’> 16

17. PCR-2eCycle 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ -------------------------------------- 3’ 5’ Dénaturation ---------------------------------- 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ -------------------------------------- 5’ 3’ 5’ ---------------------------------- ------------------------------- ----------------------------------  Appariement /Extension --------------- ----------------

18. PCR- Cycles Subséquents ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ ------------------------ -------------------- ------------------- 32 fois totale Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : 2n fois

19. Survol des Cycles du PCR • Amorces: • Courte séquence nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles • 15-30 nucléotides • Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matrices

20. Survol des Cycles du PCR • Appariement: • Température à laquelle les amorces s’apparient aux séquences complémentaires • Dois être sous le Tm des amorces • Dois être une température qui permet aux deux amorces de s’apparier • Habituellement entre 55-75oC

21. Survol des Cycles du PCR • Extension: • Fait à la température optimale pour la polymérase ADN • Habituellement 72-75oC pour la polymérase Taq

22. Polymérase Taq • Isolé d’une bactérie thermophile • Thermusaquaticus • Stable à des températures élevées • 95oC - utilisée pour dénaturer l’ADN • Aucune activité exonucléase • Pas d’autocorrection • Possède une activité deoxynucléotidyl transférase • Activité polymérase indépendante d’une matrice • Ajoute dA aux extrémité 3’OH libres

23. Amorces • Caractéristiques: • Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêt • Établis le point d’initiation de la réplication • Établis le point de terminaison de la réplication 23

24. Autocomplémentarité: 5’GGGGCCCC3’ G G G G C C C C Complémentarité de la paire 5’GGGGAAAA3’ 3’CCCC TTTT5’ Conception d’Amorces 24

25. Complémentarité 5’ Matrice 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ CCATAACCGG-OH3’ 5’CGA Complémentarité 3’ Matrice 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ TACCCATAACC TA-OH3’ Conception d’Amorces 25

26. Conception d’Amorces 3’ 3’ 5’ 3’ Région d’intérêt 3’ 3’ 5’ Région d’intérêt 3’ Bonne orientation Mauvaise orientation 26

27. 5’-AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG-3’ Problème • Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci? 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 27

28. Utilité du PCR • Amplification et isolation d’unerégiondonnée en changeantsareprésentation relative • Entre 100pb et 10Kpb • Criblage pour déterminer la présenced’uneséquenced’intérêt • Présenceou absence d’un produitd’amplification • Mutagenèsedirigée • Utilisé pour ajouterouenlever des nucléotidessur la matriceoriginale 28