360 likes | 570 Views
Analiza structurala prin raze X. Transformata Fourier si cristalografia de raze X. Cea mai mare putere a rezolutiei pentru determinarea structurilor macromoleculelor si complexelor macromoleculare.
E N D
Analiza structurala prin raze X Transformata Fourier si cristalografia de raze X Cea mai mare putere a rezolutiei pentru determinarea structurilor macromoleculelor si complexelor macromoleculare
Matematic: transformata Fourier si inversa ei convertesc dintre doua domenii (“spatii”) r (exemplu: spatiu sau timp) si domeniul k (exemple: momente sau frecvente)
Pierderea fazei prin transformata Fourier inversa unidirectionala Daca se considera faza corecta Faza incorecta (=0)
In doua dimensiuni (xy) Aranjare hexagonala a “pick”-urilor Amplitudine si faza
Unele componente au fost sterse Se regaseste distributia initiala Componente de amplitudini mici au continut redus de informatie
Aplicatie: metoda de reduce a zgomotului 1. Transformata Fourier a unui obiect zgmotos 2. Se substituie anumite componente de amplitudine mica din transformata Fourier = 0 3. Se face transformata Fourier inversa
Doar o sectiune prin transformata Fourier Distorsiunesemnificativadaca se folosestedoar un numarredus de coordonatepentrureconstructie
Exemplu de design experimental Imaginea de difractie a cristaluluiestetrasformata Fourier a structurii
Interferenta constructiva daca rS=0,+1, +2, • Interferenta destructiva daca rS=+1/2, +3/2, • Imaginea de difractie F(S) este data de:
Pentru un obiect macroscopic constand din maimultepuncte cu diverse puteri de imprastiere:
Densitatea electronica a structurii proteinei poate fi obtinuta din inversa transformatei Fourier a imaginii de difractie
In microscopie, inversatransformatei Fourier estefacuta de catre lentile!
Nu exista microscop de raze X cu rezolutie si sensibilitate suficienta • Oglinzile de raze nu au rezolutiei suficienta pentru o singura proteina. • Puterea radiatiei ar trebui sa fie prea mare iar proteina ar fi …. denaturata
Procedeu general: • Se inregistreaza imaginea de difractie a cristalului proteic • Se calculeaza inversa transformatei Fourier • Dezavantaj: se pierde informatia de faza
Problema fazelor • Metode prin care se incearca cunoasterea fazelor • Cea mai folosita metoda: inlocuirea cu atomi grei
Un specific al difractiei pe cristale macroscopice: nu se obtine o image continua ci spoturi de difractie
Celula unitara: cea mai mica unitate din care se poate genera cristalul doar prin translatii • Pentru un cristal proteic celula unitara este formata din una sau mai multe molecule
Cristalografia de raze X a proteinelor http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?template=highlights.html&pdbcode=n/a&highlights=TRUE
Producerea unor cristale adecvate Monoscrital cu geometrie si marime potrivita Transparente Fara neomogenitati Fara culoare sau indice de refractie Adecvate Neadecvate In mod obinuit, neadecvate
Se incepe cu o concentratie de proteina de 2-50 mg/ml • Nu trebuie sa contina contaminanti (alte proteine, virusuri) • Fara proteine impachetate gresit • Fara aditivi chimic care nu sunt necesari la stabilitate • Proteinele cu capete mai putin flexibile cristalizeaza mai bine • Dimensiunea optima a cristalului: ~0,1 mm
Exista kituri comerciale petru “screening” de cristalizare http://www.jenabioscience.com/cms/en/1/browse/631_macromolecular_crystallography.html
Parametri importanti: • Concentratia proteinei • Tipurile de sare si concentratia lor • pH • Tipul si concentratia surfactantilor • Temperatura • Viteza de cristalizare
Determinareafazei, inlocuirea cu atomigrei Cristalizare in solutie care contineatomigrei
Calcularea densitatii elecronice si rafinarea structurilor http://www.netsci.org/Resources/Software/Struct/xray.html