MLPA ( Multiplex ligation – dependent probe amplification )

1. MLPA(Multiplexligation – dependent probeamplification) Peter Böhm Nielsen

2. Generelt analyseflow MLPA

3. Anvendte metoder HRM & Sanger sekventering Allel 1 Allel 2 Allel 1 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Allel 2

4. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) • MLPA er en teknik til kopitalsbestemmelse af specifikke sekvenser. Dette sker ved simultan binding af op til 45 prober, hvorefter det relative antal af bundne prober bestemmes. • Til udførelsen benyttes PCR amplifikation.

5. MLPA Probehybridisering 1 Promoter Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 2 Promoter Exon 1 Intron 1 Intron 2 Exon 3

6. MLPA (1)MultiplexLigationdependingProbeAmplification • Denaturering • Hybridisering • Ligering • Amplifikation • Fragment-analyse

7. SALSA MLPA prober

8. Hybridisering • MLPA probemixblandes med denatureretgenomisk DNA. • De to sammenhørende prober hybridiserestiltilstødende target sekvenser

9. Ligering 3. Prober ligeressammenaf en thermostabilligase.

10. Amplifikation • Et universelt primer par benyttestilamplifikationafalleligerede prober. Hvertamplifikatfrahver probe har en uniklængde (130 - 480 bp).

11. Separation ogkvantiteringvedkapillærelektroforese Hver top er et amplifikatfra en specifik probe . Prøvernesammanlignes med en kontrolprøve. En forskelirelativtophøjde/areal indikerer en ændringikopitalaf den gældende probes target sekvens.

12. MLPA

13. MLPA

14. MLPA

15. MLPA

16. MLPA

17. Normal MLPA

18. MLPA Deletion af exon 5-7

19. MLPA Deletion af exon 3-16

20. MLPA Duplikation af exon 13

21. Hvad kan dette være ?

22. Kan dette være rigtigt ? Det er ikke sandsynligt at ovenstående er deletioner, da proberne mellem de 2 exons har korrekt amplifikationsstatus.

23. MLPAProbehybridisering (2) Stuffer sekvens OH P ACGTACGCACCT CCTTGATTTGGAC AGTTGGAACTAAACCTGTGCATGCGTGGATTTC Gen specifikke prober Kontroller Prober forsøges designet udenfor SNP’s

24. MLPA prober - eksempler

25. Anvendte metoder HRM & Sanger sekventering Allel 1 Allel 2 Allel 1 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Allel 2

27. Materialer og metoder CISH og FISH for HER-2 amplifikation (1)

28. Materialer og metoder CISH og FISH for HER-2 amplifikation (2) Farshid.

29. Materialer og metoder (Prøvemateriale (1))

30. Materialer og metoder (Prøvemateriale (2))Hematoxylin og eosin-farvning (HE) Cancerceller kan ”fortyndes” i normale celler Hvad har det af betydning ?

31. ResultaterNormal

32. Resultater Amplificeret

33. ResultaterMLPA vs. ISH

35. Kvalitetssikring af resultatet Quantity-peaks Q-peaks: 64, 72, 76 & 82 – indikerer DNA mængde Uafhængig af ligering

36. Kvalitetssikring af resultatet Denaturing-peaks TE TE+50mM NaCl TE+75mM NaCl D-peaks: 88, 92 & 96 – indikerer DNA kvalitet og ligerings-reaktion Afhængig af DNA &ligering D-prober er placeret tæt på CpG-island – kræver meget energi ved denatureringen

37. Raw-data vurdering (sloping) God amplifikation Uensartet amplifikation Resultater med samme signal-niveau er bedst at sammenligne. Sloping er OK til et vist punkt, hvis normalisering kan udføres. Kan skyldes fordampning – test med 8µl vand.

38. Rawdata vurdering

39. ”Skuldre” Degradering af ligerede prober: Kør MLPA-analysen direkte efter fortynding i formamid